p53转录活化的p21和Gadd45在细胞DNA损伤监视中的作用

p2 1,Gadd45均是受抑癌基因p5 3转录调控的分子 ,当电离辐射引起细胞DNA损伤时 ,p2 1,Gadd45基因的转录以p5 3依赖的方式增强 .为了深入探讨p2 1,Gadd45在DNA损伤监视中的作用 ,构建了稳定表达p2 1及Gadd45反义RNA的p2 1^as/MCF 7及Gadd45 ^as/MCF 7细胞系 .对辐射引起这些细胞G₁期阻滞、DNA损伤修复和细胞凋亡的发生进行了研究 ,发现Gadd45同p2 1一样 ,当其表达受阻后辐射引起的细胞G₁期阻滞明显减弱 ,宿主细胞对辐射损伤的报告基因的修复减弱 ,还观察到辐射引起的p2 1表达受阻的细胞调亡的增加 ,结果表明p2 1,Gadd45通过参与多种辐射细胞学反应发挥DNA损伤监视作用 .     

三氧化二砷下调MG-63骨肉瘤细胞IEX-1基因表达的转录调控机制研究

三氧化二砷(arsenic trioxide, As₂O₃)是中国传统中药砒霜的主要有效成分,最早应用于血液系统肿瘤的治疗,随后研究表明其对实体瘤也具有抑制细胞增殖并诱导凋亡的作用．早期研究发现,1.0 μmol/L的As₂O₃可以体外诱导骨肉瘤细胞系MG-63细胞凋亡,进一步的cDNA芯片分析、RT-PCR、RNA印迹证实细胞凋亡与As2O3干预后IEX-1基因表达下调有关．IEX-1为早期诱导应答基因,调节细胞生长和凋亡．通过荧光素酶分析,EMSA、蛋白质印迹等实验,发现As₂O₃干预骨肉瘤细胞系MG-63后能诱导p53蛋白表达上调,增加的p53蛋白通过与IEX-1的启动子结合,转录抑制IEX-1的转录,导致IEX-1基因表达下调．进一步证实了IEX-1与骨肉瘤的重要关系,同时也阐明As₂O₃诱导IEX-1基因表达下调的转录调控机制．     

肝癌肿瘤干细胞的分离鉴定及差异性小分子RNA筛选

旨在分离并鉴定肝癌肿瘤干细胞,并对其异常表达的microRNA进行了初步筛选。首先利用流式细胞术及免疫荧光技术分别在肝癌细胞系及肝癌组织标本中确认了CD90⁺细胞的存在;随后利用免疫磁珠分选技术从肝癌细胞系MHCC97-H中分离出了CD90⁺细胞,化疗药物耐药性实验表明,CD90⁺细胞具有明显的化疗药物耐受能力;两次裸鼠皮下成瘤性实验也表明CD90⁺细胞具有较强的成瘤能力,而CD90^-细胞不具备成瘤能力。上述实验充分说明:CD90⁺细胞具有肝癌肿瘤干细胞特性。因此利用该细胞模型进行了肝癌肿瘤干细胞CD90⁺细胞和非肝癌肿瘤干细胞CD90^-细胞之间差异表达的microRNA的检测,结果表明,CD90⁺细胞与CD90^-细胞之间共有92个microRNAs的表达存在差异性,其中在CD90⁺细胞中高表达的microRNAs有52个;在CD90^-细胞中高表达的microRNAs有40个。     

CHO/dhfr-细胞定点整合高效表达系统的建立

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k₂tPA)、扩增基因（dhfr）、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因（neo）,且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr^－细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点（Hot spot）区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统（FLP-FRT）将外源基因定点整合到Hot spot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k₂tPA的高表达,表达量达到17.1μg/10⁶cell·24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。     

照射后HeLa细胞对CDDP诱导的DNA交联产生抗性

应用EB荧光分析法测定了人宫颈癌上皮细胞系(HeLa line)经单次 ⁶⁰Co照射后顺铂(CDDP)诱导的DNA链内交联反应(ct％).经研究发现,1～6 Gy照射后,细胞相对生长分数(fraction of control growth,FCG) 减小,单位细胞DNA含量增高,HeLa细胞与CDDP的交联反应明显降低,且与照射剂量呈依赖关系.结果提示,γ射线照射后存活的肿瘤细胞可能对CDDP或烷化剂的化学治疗作用产生抗性.     

细胞周期相关蛋白cyclin D1、p53和p21WAF1/Cip1在食管鳞癌中的表达改变及其病理学意义

食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我国常见的恶性肿瘤之一, 虽然临床诊治手段正逐步改进, 但中晚期患者5年生存率仍然很低。目前认为细胞周期调控异常与肿瘤发生发展关系密切, 然而相关周期调节蛋白在食管癌患者中的表达改变、临床意义及其应用价值还没有明确结论。文章应用组织微阵列联合免疫组织化学技术(TMA-IHC), 对148例食管鳞癌组织标本中细胞G₁/S期调控蛋白cyclin D1、p53和p21^WAF1/Cip1的表达进行检测, 分析其与临床病理参数之间的相关性。结果显示, cyclin D1与p53蛋白在食管癌细胞中表达升高, p53表达阳性率与区域淋巴结转移显著相关(P = 0.001)。p21^WAF1/Cip1蛋白在肿瘤组织中表达降低, 且p21WAF1/Cip1表达阴性患者的术后生存时间显著短于表达阳性的患者(P = 0.001)。多因素生存分析显示p21WAF1/Cip1是一个独立的预后因素(相对危险度为0.418, P<0.001)。微阵列比较基因组杂交(array-CGH)检测进一步表明45.4%的食管癌患者存在cyclin D1基因扩增。以上结果提示食管鳞癌中存在细胞周期G1/S期调控异常, p21^WAF1/Cip1蛋白可能是一个有应用价值的预后因子。     

肺腺癌A549/DDP细胞周期变化及其多药耐药性

用Fura-2/AM标记药物敏感的肺腺癌细胞A₅₄₉和抗顺铂药物的肺腺癌细胞A₅₄₉/DDP两种细胞胞内游离Ca²⁺,用碘化丙锭(PI)标记细胞DNA,检测其胞内Ca²⁺的变化及两种细胞增殖能力和细胞周期.实验结果表明,抗药性细胞株A₅₄₉/DDP胞浆内游离Ca²⁺的浓度仅为药物敏感细胞株A₅₄₉的1/3左右,同时前者的细胞增殖能力较后者明显增强,而且细胞周期也明显缩短.当用BAPTA-AM和EGTA或A₂₃₁₈₇和Thapsigargin处理细胞以降低或升高其胞内自由Ca²⁺浓度时可改变细胞的生长周期,二者也呈现明显差别.这些结果表明,对顺铂产生耐药性的人肺腺癌A₅₄₉/DDP细胞胞内Ca²⁺浓度的降低,可能影响细胞的增殖,缩短细胞的生长周期,特别是影响起决定作用的G1期,从而有利于肿瘤细胞多药耐药特性的维持.     

L7811鼠腹水肿瘤细胞 31P核磁共振的研究

用 ³¹P核磁共振技术(³¹P-NMR)研究了L₇₈₁₁鼠腹水肿瘤细胞和615系鼠胸腺细胞(正常对照细胞)。结果发现在肿瘤晚期阶段,L₇₈₁₁腹水肿瘤细胞的含磷化合物未进入完全不活跃状态。此外,腹水肿瘤细胞的磷脂组成与含量亦有明显改变。因此, ³¹P-NMR谱可做为观察肿瘤细胞内能量生成和某些磷脂合成宏观动态过程的一项参考指标。     

槲皮素对结肠癌细胞生长的影响

通过MTT试验观察槲皮素对结肠癌细胞系RKO生长的影响;通过流式细胞仪技术观察槲皮素对细胞周期和细胞凋亡的影响;采用RT-PCR和western印迹技术,确定槲皮素对p21、p27和p53表达的影响.MTT法显示槲皮素加药组生长抑制作用明显,且具有剂量依赖性;流式细胞仪分析结果显示,经5μmol/L槲皮素作用后细胞周期明显阻滞在G0/G1期;5、10、20μmol/L3个剂量组的细胞凋亡率分别为23.4%、24.2%、47.9%,而对照组为13.2%;p21和p27的mRNA及蛋白质表达水平上调,促凋亡蛋白p53表达水平上调.因此,槲皮素对RKO生长有明显的抑制作用,槲皮素可能通过上调p21和p27表达使RKO细胞周期阻滞于G0/G1期,可能通过上调促凋亡蛋白p53表达诱导RKO细胞发生凋亡.     

PER1对人肝癌细胞BEL-7402辐射敏感性的影响

本文通过X射线照射SMMC-7721、BEL-7402和HepG2三种肝癌细胞后,以克隆形成试验检测其存活分数,结果显示在梯度剂量X射线0、2、4、6、8、10 Gy照射下SMMC-7721、BEL-7402、HepG2三种细胞克隆存活分数逐渐下降,其中SMMC-7721在三种肝癌细胞系中对辐射最敏感,BEL-7402辐射抗性在三种肝癌细胞系中最高。Western blot检测发现PER1在SMMC-7721中的表达水平明显显著高于BEL-7402和HepG2(P<0.05)。过表达PER1蛋白以后,BEL-7402接受5 Gy X射线照射后凋亡明显增多,同时,western blot和RT-qPCR试验结果发现,X射线照射过表达PER1的BEL-7402细胞,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低,凋亡执行蛋白Caspase-3断裂明显增多。研究结果表明PER1蛋白的高水平表达可以促进X射线诱导的凋亡,增强肝癌细胞的辐射敏感性。     

RMP基因干扰对肝癌细胞周期的影响

目的:建立RMP(RPB5-Mediating Protein)基因干扰的稳定细胞株,研究RMP基因干扰对正常肝细胞及其肝癌细胞周期的影响.方法:构建RMP基因的短发卡RNA(short-hairpin RNA,shRNA)真核表达载体pGPU6-Neo-RMPi-484.通过脂质体转染的方法转染到SMMC-7721肝...     

肝细胞癌组织中OATP1B3的表达及其作用的初步研究

摘要 目的：探讨有机阴离子转运多肽1B3（OATP1B3）在肝细胞癌（肝癌）组织中的表达及作用。方法：通过免疫组化实验和免疫印迹试验（Western blot）检测肝癌组织及其癌旁组织中OATP1B3情况,并分析其与患者临床病理特征的相关性。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测OATP1B3在多株肝癌细胞中的表达情况,选择表达量相对较低的人肝癌细胞（HepG2和Huh7）细胞进行过表达实验,细胞毒实验（MTT）和流式细胞术分别检测OATP1B3对细胞增殖及凋亡的影响。结果：肝癌组织中OATP1B3表达水平明显低于癌旁组织（P<0.05）,且与患者恶性肿瘤国际临床病期分类（TNM分期）、肿瘤分化程度、有无肿瘤复发显著相关（P<0.05）。过表达OATP1B3可抑制HepG2和Huh7细胞增殖,促进细胞凋亡。结论：OATP1B3在肝癌组织中低表达,上调其表达可抑制肝癌细胞增殖和促进细胞凋亡。OATP1B3可能是肝癌的抑癌基因,对肝癌的发生、发展具有重要作用。     

紫花牡荆素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的：研究紫花牡荆素（Casticin）对肝癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用,并探讨其作用机制。方法：用终浓度为0、0.5、1.0、2.0umol/L的Casticin作用于HepG2细胞,于12、24、48h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率;Hoechst33342核染色,观察细胞形态学变化;24h后收集各组肝癌HepG2细胞,流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;RT-PCR检测survivin mRNA表达。结果：MTT法检测显示,Casticin对肝癌HepG2细胞有增殖抑制作用,并存在浓度和时间依赖关系;Hoechst33342染色后,可见核染色质凝集,凋亡细胞呈致密浓染,与对照组相比,Casticin处理后凋亡细胞比例增加;Casticin作用24h后,细胞被阻滞于G2/M期,随药物质量浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加;RT-PCR结果显示,Casticin下调肝癌HepG2细胞survivin mRNA表达。结论：Casticin在体外对肝癌HepG2细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用,初步推断Casticin诱发肝癌细胞凋亡与其对survivin基因表达的抑制有关。     

RTN4-C基因在肝癌组织中的表达及其对SMMC7721细胞生长和凋亡的影响

RTN4-C属于编码内质网蛋白的基因家族(RTNs)。为研究RTN4-C在肝癌及其癌旁组织中的表达情况及其对SMMC7721肝癌细胞株的影响,利用RT-PCR检测RTN4-C在肝癌及其癌旁组织中的表达。构建RTN4-C-pcDNA3.1真核表达重组质粒,用脂质体介导转染SMMC7721肝癌细胞,通过G418稳定筛选,建立转染RTN4-C/SMMC7721稳定细胞株。MTT法测定转染前后细胞生长改变、吖啶橙染色检测细胞凋亡改变、免疫细胞化学检测肿瘤相关蛋白p53、Hsp70和c-Fos表达改变。结果表明,RTN4-C/SMMC7721细胞生长减慢,与对照组相比,第2、3、4d细胞生长抑制率分别为33·8%±0·026、56·2%±0·094、34·8%±0·077;凋亡明显增多。突变型p53蛋白从核内转移到细胞质且表达减弱,c-Fos、Hsp70蛋白表达量明显减弱。提示RTN4-C基因在肝癌组织中存在表达差异,促进突变型p53的核转移并减少其表达量、抑制癌基因c-Fos和Hsp70的表达,从而抑制SMMC7721细胞的生长,促进其凋亡。     

长链非编码RNA对HepG2 肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨长链非编码RNA RP13-514E23.1在肝癌细胞系中的表达,并观察上调该基因后其下游基因MAPK10的变化及对肝癌细胞Hep G2增殖、凋亡的影响。方法:通过荧光定量PCR(q RT-PCR)检测RP13-514E23.1在正常肝细胞与肝癌细胞系中的表达差异,进一步构建质粒转染肝癌Hep G2细胞上调RP13-514E23.1的表达,以Mock组(只加转染试剂)和NC组(转染空载体pc DNA3.1-NC)作为对照评估转染效率及对MAPK10表达的影响。用CCK-8实验和流式细胞术检测转染前后Hep G2细胞的增殖、凋亡的变化。结果:Lnc RNA RP13-514E23.1在大部分肝癌细胞系(Hep G2,SMMC,Huh7,Hep3B)中的表达明显低于正常肝细胞(0.58±0.05 vs 1.00,P0.05);转染pc DNA-RP13-514E23.1后,q RT-PCR检测Hep G2细胞的RP13-514E23.1和MAPK10m RNA表达量显著升高(分别为29.90±1.40、2.42±0.25,P0.05),western blot检测MAPK10蛋白表达量较对照组也升高(2.10±0.16,P0.05);CCK-8结果显示Hep G2细胞在各个时间段增殖均受到抑制(P0.01),Mock组、NC组和实验组的凋亡率分别为(5.53±1.17)%、(6.40±2.84)%和(46.87±3.45)%(P0.01)。结论:Lnc RNA RP13-514E23.1在肝癌细胞系中表达异常降低,上调其表达后MAPK10的表达升高,且Hep G2细胞增殖受到抑制、凋亡增加。     

mad—overexpression down regulates the malignant growth and p53 mediated apoptosis in human hepatocellular carcinoma BEL—7404 cells

Mad protein has been shown as an antagonist of cMyc protein in some cell lines.The effect of Mad protein to the malignant phenotype of human hepatoma BEL-7404 cell line was investigated experimentally.An eukarryotic vector pCDNA Ⅲ containing full ORF fragment of mad cDNA was transfected into targeted cells.Under G418 selection,stable Mad-overexpressed cells were cloned.Studies on the effect of Mad over-expression in cell proliferation and cell cycle revealed that cell morphology of the Mad-overexpressed BEL-7404-M1 cells was significantly different from the parent and control vector transfected cells.DNA synthesis,cell proliferation and anchorage-independent growth in soft-agar of the madtransfected cells were partially inhibited in comparison to control cells.Flos cytometry analysis indicated that mad over-expression might block more transfectant cells at G0/G1 phase,resulting in the retardation of cell proliferation.RT-PCR detected a marked inhibition of the expression of cdc25A,an important regulator gene of G0/G1 to S phase in cell cycle.It was also found that Mad protein overexpression could greatly suppress p53-mediated apoptosis in BEL-74040M1 cells in the absence of serume.Thus,Mad proteins may function as a negative regulator antagonizing c-Myc activity in the control of cell growth and apoptosis in human hepatocellular carcinoma BEL-7404 cells.