用固定化细胞裂解苄基青霉素制备6-氨基青霉烷酸

高产青霉素酰化酶的大肠杆菌细胞用明胶包埋,并由戊二醛将其固定。这种固定化细胞用来连续水解苄基青霉素,在37℃使用103天没有发现损失酶活性。它们已被用于6-氨基青霉烷酸的工业生产,效果令人满意。在七个半月内使用285次,水解速率没有明显下降。研究了固定化大肠杆菌细胞的酶性质,并与相应的天然细胞作了比较。发现固定化细胞的青霉素酰化酶比天然细胞的更稳定。     

固定化大肠杆菌AS1.76青霉素酰化酶的研究

用固定化青霉素酰化酶连续生产6-氨基青霉烷酸(简称6-APA)已有许多报道。近年来关于固定化微生物细胞的研究不断发展。Sato等曾用固定化的产青霉素酰化酶的细胞连续生产6-APA。我们用双功能试剂戊二醛固定化大肠杆菌AS 1.76的青霉素酰化酶,用来水解青霉素G生产6-APA。现将结果报告如下。     

产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76的固定化

用在有机溶剂中成型的琼脂凝胶包埋,结合戊二醛处理的方法,制备产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76固定化细胞,其细胞含量可达50%以上。固定化细胞水解青霉素 G 钾盐的最适 pH 为8.0,比原细胞约高0.3pH 单位;最适温度与原细胞一样,均为45℃。固定化后,Hg2+对酶抑制作用降低,但酶对Fe3+、Cu2+等金属离子敏感性增加。在无底物情况下,与原细胞相比,固定化细胞对 pH 和热的稳定性增加;4℃保存14个月无活力损失。固定化细胞装柱,在pH7.7,37℃下连续裂解青霉素 G,转化率达95%以上。155天无明显酶活力损失。     

环氧聚胺——一种细胞固定化的新型交联剂

近年来随着人们对酶和微生物细胞固定化研究的逐渐深入,对固定化的各种载体材料和固定化方法也进行广泛研究。本文报道一种固定化酶的新型交联剂——环氧聚胺(Epoxy-polyamine简称E.P.A.)用于游动放线菌葡萄糖异构酶和大肠杆菌青霉素酰化酶交联固定化的研究结果。一、材料和方法 1.菌体及试剂 (1)菌体含青霉素酰化酶之大肠杆菌,由华北制药厂提供。含葡萄糖异构酶之游动放线菌,由上海新型发酵厂提供。 (2)环氧聚胺上海市化学试剂商店。     

扩散效应对固定化细胞裂解青霉素的影响

考察了扩散效应对明胶-戊二醛包埋法制备的固定化高产青霉素酰化酶大肠杆菌细胞裂解反应速度的影响。以有效系数η的大小来判断内扩散阻力的程度。η值代表固定化细胞表现活性与匀浆后固定化细胞活性的比例。     

固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键连接到醋酸纤维素载体上,制成的固定化青霉素酰化酶的表观活力达2000 u／g左右(PDAB法)。水解lO％(w／v)的青霉素G钾盐落液,使用30批,保留活力70％以上。6-氨基青毒烷酸(6-APA)总收率平均达88．37％。固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的最适pH为9．95,最适温度为55℃,表观米氏常数为1.093×10-2mol／L,在pH 5．8-10．7,温度45℃以下酶的活力稳定。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶在新型环氧载体ZH-HA上的固定化

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶共价结合在新型环氧-氨基型载体ZH-HA 上,通过对酶浓度、固定化时间、pH以及缓冲液浓度等条件的考察,确定了最优固定化条件:50 mg比活力6000 U/g的巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶蛋白和1g ZH-HA悬浮于pH 9.01 mol/L磷酸缓冲液,室温搅拌6 h,制得固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶,活力2126 U/g湿载体,活力回收率7.67%.比较研究了固定化酶与原酶性质,原酶最适温度45℃,最适pH为8.0.固定化酶则分别是50℃和9.0,分别比溶液酶偏移5℃、1.0个pH单位.经过40批连续水解青霉素G钾盐,固定化巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶仍保持80%的活力,显示出良好的工作稳定性.     

颗粒状固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚合物载体EupergitC颗粒环氧基团上 ,制成的颗粒状固定化青霉素酰化酶表现活力达 1 40 0 μ/g左右。固定化酶水解青霉素的最适 pH8 0 ,最适温度为 55℃。在pH6 0～ 8 5、温度低于 40℃时固定化酶活力稳定。在 pH8 0、温度 37℃时 ,固定化酶对青霉素的表现米氏常数Ka为 2×1 0 - 2 mol/L ;苯乙酸为竞争性抑制剂 ,抑制常数Kip为 2 8× 1 0 - 2 mol/L ;6 APA为非竞争性抑制剂 ,抑制常数Kia为 0 1 2 5mol/L。固定化酶水解青霉素 ,投料浓度为 8% ,在使用 2 0 0批后 ,保留活力 80 %左右 ,6 APA收率平均达 89 48%。     

固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶酶促合成头孢氨苄的研究

β—内酰胺系列抗菌素抗菌谱广、疗效高、毒副作用小,国际上研究与应用日渐广泛深入。头孢氨苄(Cephalexin)是重要的半合成抗菌素之一,由头孢霉素母核7—氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(简称7-ADCA)和侧链结构物苯甘氨酸或其甲酯(PGME)经酰化而生成。酰化有化学法和酶法两种。采用青霉素G酰化酶或a—氨基酸酯酶或,a—氨酰转移酶的酶法,具有工艺操作简单、无需基团保护、环境污染轻等优点。继日本人于70年代初试验成功酶法之后,80年代初我们开展了这方面研究。制备方面,胞外酶优于胞内酶;使用方面,固定化酶优于固定化细胞。在用具有青霉素G酰化酶活性的固定化大肠杆菌(Escherichia coli)细胞合成头孢氨苄的基础上,又研究了用固定化巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BP931胞外青霉素G酰化酶酰化合成头孢氨苄的条件。本文报道这一研究结果。     

渗透压冲击法快速高效提取青霉素酰化酶

青霉素在临床上的大量使用造成了细菌的耐药性增强,青霉素本身又具有不宜口服、过敏性强等缺点,人们正致力于研究有诸多优良特性的半合成青霉素。大肠杆菌青霉素酰化酶用于裂解青霉素生产6-氨基青霉烷酸(即6-ＡＰＡ,半合成青霉素的重要中间体),该酶的提取、纯化和固定化研究在半合成青霉素工业有重要的意义[1]。大肠杆菌青霉素酰化酶属胞内酶,文献报道多采用超声波法提取,该法得到的粗酶液比活低,一般要经过四、五步纯化才能得到较高比活[2,3,4]的酶液。采用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶,得到的粗酶液比活高,只需经过硫酸铵沉淀一步纯化就…     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达Ⅲ、温度在转录水平调控青霉素酰化酶基因表达

高表达的基因工程菌大肠杆菌A56(pPA22)青霉素化酶基因表达对温度敏感。在37℃几乎不产生青霉素酰化酶,在28℃以下积累青霉素酰化酶,合成酶的最适温度为20—22℃,产量可达250u,100ml。当用DNA—RNA点滴杂交法定量分析RNA时,发现在37℃培养的细胞中不积累青霉素化酶mRNA,而22℃培养的细胞中相应mRNA的量是28℃培养的细胞中的5倍。同一质粒pPA22上的氯霉素乙酰转移酶的mRNA在三种温度培养的细胞中的。浓度相同。将37℃培养的细胞转移到22℃继续培养,当菌体不继续增殖时,细胞内仍无青霉素酰化酶及其mRNA的积累。上述结果表明温度在转录水平上专一地调控了青霉素酰化酶基因的表达,在37℃长时期培养的细胞中青霉素酰化酶基因被永久地关闭。     

以聚丙烯腈纤维为载体制备固定化青霉素G酰化酶的研究

以酸部分水解聚丙烯腈纤维为载体 ,以戊二醛为交联剂 ,共价键结合制备了固定化胞外青霉素G酰化酶。当水解后的载体中 NH2 基含量为 690 μmol g和含水量为 64%时 ,对酶蛋白的固定量达 1 0 0mg g以上 ,固定化酶的活力达 2 30 0IU g ,酶活力总产率为 30 % ,固定化效率为 56%。酶活力的总产率和固定化率随加酶量的增加而降低。该酶可以将浓度为 2 5%～1 2 5%的青霉素G钾盐水解 98%以上。批投青霉素G钾盐为 1 0g,酶负荷为 1 50IU g(PGK) ,经2 0批水解反应后 ,剩余酶活力为 80 %。用二硫基苏醣醇处理固定化酶 ,对水解青霉素G钾盐的操作稳定性有促进作用。固定化酶的室温保存半衰期为 1 30d。用戊二醛和硼氢化钠溶液处理固定化酶后 ,酶活力的室温保存稳定性有所降低。     

青霉素酰化酶在新型复合载体上的固定化研究

通过γ-氯丙基三甲氧基硅烷的媒介,将聚乙烯亚胺(PEI)化学偶联在硅胶微粒表面,制备了新型复合载体PEI/silica gel,然后通过双官能团试剂戊二醛的作用,将青霉素酰化酶固定在复合载体上;考察了戊二醛用量、pH值、固定化温度、固定化时间及给酶量等条件对固定化青霉素酰化酶表观活力、活性回收率等性能的影响;并通过测定复合载体在固定化前的ζ电位,探索了复合载体PEI/silica gel固定化酶的作用机理。研究结果表明,由于PEI分子链中含有大量胺基,共价键联与物理吸附相结合,使青霉素酰化酶被快速稳定地固定化,并具有高的催化活性与活力回收率。复合载体PEI/silica gel(0.5 g)固定青霉素酰化酶的适宜固定化条件为:固定化温度为30℃;固定化时间为14~15 h;戊二醛用量为1.2 mmol/g;pH=7.92;给酶量为0.1 mL/g。     

青霉素酰化酶在快速蛋白液相色谱仪上的分离纯化

由大肠杆菌AS1.76产生的青霉素酰化酶具有水解青霉素G产生6-APA,水解重排酸产生7-ADCA的作用,并且也具有合成青霉素类或头孢霉素类的作用。为了研究酶的物理化学性质,我们用Pharmacia FPLC系统对比酶进行了分离纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达I．青霉素酰化酶基因的克隆

用EcoR I—Pst I双酶解的pBR322作为克隆载体,从大肠杆菌D816染色体克隆了青霉素酰化酶基因,这个基陶位于9．1Kb EcoRI片段上。所得克隆株整体细胞酶学特性与大肠杆菌D816一致,酶反应最适温度为55℃,最适pH为7．8—8．0。以青霉素G作为底物时Km为10．3mM,转化产物为6一氨基青霉烷酸。克隆株大肠杆菌c600(pPAl)合成青霉索酰化酶仍需苯乙酸诱导并被葡萄糖阻遏,细胞青霉素酰化酶的活性比大肠杆菌c P1(高2—4倍。     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。     

固定化酶-离子交换组合系统进行青霉素G水解生产6-APA的模型化研究

采用固定化青霉素酰化酶(Penicillin acylase)在反应器中进行青霉素G水解生产6－APA,同时与离子交换柱相组合以连续地去除反应混合液中的苯乙酸。建立了离子变换柱的分格模型(Comparunent model)．在确定了青霉素G和苯乙酸沿柱高的浓度分布的基础上,与描述固定化酶反应器的状态方程相结合,得到了固定化酶－离子交换组合系统的数学模型。在将计算机模拟值与实验值进行验证后,探讨了组合系统中树脂量、循环流速和组合起始时间对青霉素G酶解过程的影响。     

简讯

青霉素酰化酶水解青霉素-G生产6-氨基青霉素烷酸(6-APA)我们从9个属234株细菌中筛选出19株产青霉素酰化酶的大肠杆菌,其中AS1.76和E110两株菌的酶活较强。通过培养条件试验,选出了两种适宜的培养基。一种是玉米浆-蔗糖培养基,另一种是鱼胨培养基,     

几种纤维素及无机吸附载体对青霉素酰化酶的吸附作用及其固定化

本文就几种纤维素和无机吸附载体对青霉素酰化酶的吸附作用及其固定化进行了研究,结果表明:DEAE-纤维素、EYI-纤维素、微晶纤维素、CM-纤维素、羟基磷灰石、中性氧化铝、硅藻土及粉末状膨润土对青霉素酰化酶都有很强的吸附能力,其固定化青霉素酰化酶的比活分别在1.47～19.43u/g之间,活力回收率为16.3％至84％,几种固定化酶的最适pH均较游离酶低,且其操作稳定性较好。     

固定化青霉素G酰化酶水解头孢菌素G制备7—ADCA的研究

用聚丙烯腈纤维固定化青霉素酰化酶水解头孢菌素G制备7-ADCA,固定化酶对头孢菌素G的最适pH为9.0,最适温度50℃。在37℃、pH8.0固定化酶对头孢菌素G的表观米氏常数为1.67×10~(-2)mol/L。最大反应速度为3.01mmol·g~(-1)·min~(-1)。头孢菌素G溶液浓度在2％以上时,对固定化酶有明显的抑制作用。固定化酶水解头孢菌素G的最佳投料浓度为5％～6％,水解时用酶量以每克头孢菌素G投300U以上为好。按上述条件水解头孢菌素G,操作25批后固定化酶保留活力77.8％,7-ADCA平均收率92.68％。