精子介导外源DNA转基因技术

转基因技术在现代生命科学研究、药物开发、临床治疗、遗传育种等方面发挥重要作用.精子介导转基因技术(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是以精子细胞为载体,携带外源基因进入卵细胞受精,从而获得转基因动物.该文回顾了SMGT的历史发展,简述了SMGT的分子机制,包括外源DNA与精子的相互作用...     

大球母贝精子介导外源基因转移研究

将大球母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍａｘｉｍａ Ｊａｍｅｓｏｎ）精子与“全鱼”ＧＨ基因重组体ｐＣＡｇｃＧＨ和ｐＣＡｇｃＧＨｃ的线性ＤＮＡ混合,温育３０ｍｉｎ,经６次、２＾７、１０ｋＶ脉冲电处理后,与卵子受精,得到若干贝苗。从贝苗中提取ＤＮＡ,经ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交表明,部分受体带有外源基因,当与精子温育的外源基因浓度分别为２μｇ／ｍＬ,６μｇ／ｍＬ及１８μｇ／ｍＬ时,相应贝苗     

精子介导的转基因技术

精子介导的转基因技术是近十几年发展起来的一种新技术。从各个种的实验证明,精子有瞬间吸收外源DNA的能力。这一过程由一系列因子起重要调节作用。一种特异的DNA结合蛋白介导了外源DNA与精子的结合,同时精浆中存在一种因子起抑制两者结合的拮抗作用。CD4分子与外源基因的内化有关。内化的DNA可能与精子核支架结构（nuclear scaffold)结合,并整合或重排。但仍需要大量实验数据进一步证明是否产生真正可遗传的转基因后代,及如何提高转基因效率,以使这一方法得到普遍的推广及应用。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胚胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用 DIG 末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异（P<0.01）,平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

大珠母贝精子介导外源基因转移研究

将大珠母贝(PinctadamaximaJameson)精子与“全鱼”GH基因重组体pCAgcGH和pCAgcGHc的线性DNA混合,温育30min,经6次、2⁷、10kV脉冲电处理后,与卵子受精,得到若干贝苗。从贝苗中提取DNA,经PCR扩增和Southernblot分子杂交表明,部分受体带有外源基因,当与精子温育的外源基因浓度分别为2μg/mL,6μg/mL及18μg/mL时,相应贝苗携带外源基因比率分别为56%,20%和50%。即在此范围内,基因转移的阳性率与外源基因的浓度呈正相关。     

DNA—处理的精子作为基因转移载体

继１９８９年首次报道成功地利用精细胞作为载体把ＤＮＡ转入小鼠胚胎及随后ＤＮＡ整合入小鼠基因组后,现又取得了一些进展和新的发现。据报道,ＤＮＡ可结合或掺入不同种类的动物和昆虫的精子中,包括小鼠、猪、山羊、绵羊、牛、鸡、鲤鱼、海胆、蜜蜂和丽蝇类等。通常,人们用脂质体或电激法来促进ＤＮＡ进入精细胞。这些研究出现的一个意外结果是质粒转基因作为染色体外遗传因子的持久性。１９９５年,澳大利亚研究人员在《动物生物技术》杂志上曾发表了一篇用ＤＮＡ处理的精子人工授精生产转基因牛的报道。经Ｓｏｕｔｈｅｍ印迹分析表明…     

电脉冲作用将外源基因导入稀有ju鲫精子的研究

将稀有ju鲫（Gobiocypris rarus）精子与重组质粒pGAhLFc线性DNA混合温育,经电脉冲处理后与卵子受精,孵化出苗。从鱼苗中提取DNA,经PCR检测,25.5%～66.7%鱼苗带有外源基因。在显微镜下观察经电脉冲处理过的精子,发现其活力有不同程度下降,受精率也有不同程度下降,说明不同的电脉冲条件对精子有不同程度的损害作用。精子与外源DNA混合温育,经电脉冲处理后,用DNA外切酶消化后,提取精子DNA,经PCR检测,仍有阳性电泳带,证明电脉冲可以促使稀有ju鲫精子摄入外源基因。     

通过睾丸内注射转染外源DNA在小鼠精子的表达

为研究睾丸内注射外源DNA法生产转基因小鼠(Mus musculus)的可行性,并探讨注射DNA的最佳浓度。将环形的质粒DNA pEGFP-N1与脂质体混合制备DNA-脂质体复合物,按DNA浓度不同分为0.08μg/μl、0.12μg/μl和0.24μg/μl3组,分别注射入成年SPF级昆明小鼠睾丸内,同时设空白对照;每组处理公鼠2只,注射5d后每只与3只成年母鼠同笼,20d后在荧光显微镜下检测公鼠附睾精子,并制作睾丸石蜡切片,检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达;PCR法检测各组后代阳性率。结果显示,3组小鼠附睾荧光精子比例分别为9.09%、47.06%和27.78%。3组小鼠的睾丸石蜡切片中均可看到不同强度的GFP表达。后代经PCR检测阳性率分别为17.26%、47.61%和22.11%。本实验证实了睾丸注射法能使外源DNA整合进入精子基因组,并能在自身和后代中得到表达,本研究中外源DNA注射浓度以0.12μg/μl效果为最佳。     

中华蜜蜂精子介导egfp基因转移

中华蜜蜂Apis cerana cerana是一种真社会性昆虫,也是我国重要的经济昆虫。本实验目的是为了检测精子是否可以作为载体将外源egfp基因介导转入中华蜜蜂。首先将雄蜂精子与线性化的质粒DNA共浴,然后通过人工授精技术将精子导入处女王,再对实验蜂群后代进行分析。结果显示EGFP蛋白在一群实验组蜂的1～2日龄小幼虫中表达较强,能检测到0.01%～0.02%荧光阳性小幼虫个体;通过PCR和RT-PCR技术分析,证实转入的外源egfp基因获得表达。实验结果表明精子载体法能够用于中华蜜蜂外源基因的转移和表达。     

蜜蜂精子介导GFP基因转移研究

江西农业大学动物科技学院郭冬生、天津农学院张巧利和泉州师范学院模式生物研究中心孙亮先三位动物分子生物学研究工作者将pGFP-2质粒线性化,利用精子介导,通过人工授精技术导入意大利蜜蜂处女王．然后将授精王介绍到无王群中繁殖后代,其结果显示：试验群产生了一群绿色荧光阳性蜜蜂,他们对此阳性蜂群后代分析发现,1～2日龄幼虫能坳4到荧光,提取蜜蜂DNA进行PCR扩增到预想的片断。     

采用高分子介导精子作载体制备转基因泥鳅

为探讨树形高分子介导精子载体技术产生转基因动物,将泥鳅精子与具有标记基因LacZ的pCH110重组质粒和树形高分子在保存液内孵育,经DNA原位杂交检测发现树形高分子介导下精子携事外源DNA的效率得到较大的提高,将捕获了外源DNA的精子,再与泥鳅卵进行体外人工受精。由此发育的鱼苗经PCR和LacZ组织化学检测,获得了高比例的转基因泥鳅,外源基因LacZ在泥鳅幼苗头部得到了明显表达。     

应用放射性自显影技术检测外源DNA与鸡精子的结合

应用放射性自显影技术检测外源ＤＮＡ与鸡精子的结合ＤＥＴＥＣＴＩＮＧＡＳＳＯＣＩＡＴＩＯＮＯＦＥＸＯＧＥＮＯＵＳＤＮＡＷＩＴＨＣＨＩＣＫＥＮＳＰＥＲＭＵＳＩＮＧＡＵＴＯＲＡＤＩＯＧＲＡＰＨＹ关键词鸡，精子，脂质体，ＤＮＡ与精子的结合ＫｅｙｗｏｒｄｓＣｈ...     

精子介导的转基因技术

精子介导的转基因技术是近十几年发展起来的一种新技术.从各个种的实验证明,精子有瞬间吸收外源DNA的能力.这一过程由一系列因子起重要调节作用.一种特异的DNA结合蛋白介导了外源DNA与精子的结合,同时精浆中存在一种因子起抑制两者结合的拮抗作用.CD4分子与外源基因的内化有关.内化的DNA可能与精子核支架结构(nuclear scaffold)结合,并整合或重排.但仍需要大量实验数据进一步证明是否产生真正可遗传的转基因后代,及如何提高转基因效率,以使这一方法得到普遍的推广及应用.     

利用精子介导法向蚕卵导入外源基因的研究

为建立家蚕转基因中切实可行、操作简便的外源基因导入方法,进行了精子介导法探索,以精子介导法的三种方式向家蚕导入所构建质粒pFbGFP,并通过PCR扩增和DNA印迹等手段,已连续两代从基因组DNA检测到导入外源基因GFP的存在,其中的一种导入方式到第二代阳性率约30% .结果表明该法可有效进行家蚕转基因的外源基因导入.     

精子介导转基因动物的研究进展

精子是高度分化的细胞,它具有潜在的结合外源DNA并在受精过程中将其转入到卵内的能力。随着受精卵的发育,外源基因将随机整合到受体基因组中,部分基因能在成体中表达,部分基因不仅能表达还能遗传给后代。一旦精子能表达外源基因,那么将很容易得到大量的转基因后代。因此,精子能携带外源基因入卵和产量丰富这两大特性使精子作为载体制备转基因动物成为一个简便的途径。精子载体法制备转基因动物无需昂贵的实验设备,亦无需专门的技术。因此,提出后就备受关注。介绍精子介导的转基因动物的制作原理及具体方法的研究进展。     

低能离子注入介导外源DNA转化的原理与应用

低能离子注入介导外源DNA转化是分子杂交育种的一种有效的途径,被广泛应用于植物和微牛物的品质改良及种质创新并在农业、工业的生产应用方面奠定了很好的基础.本文简述了低能离子注入介导外源DNA转化技术的基本原理,低能离子的注入对受体产生了通道作用、吸引作用、损伤作用和吸胀作用的验证性实验,介绍了该技术在成功创制玉米稻、高蛋白小麦品系和株系的基础上进行转化植物和微生物方面取得的成果,分析了该研究领域包括实验技术、实验材料、实验结果方面存在一些问题并提出初步解决设想.     

肌肉介导的基因转移DNA药物及应用研究

介绍了肌肉介导的基因转移方法,探讨肌肉摄取DNA的机理,DNA药物的预防和治疗作用机制,DNA药物的具体应用以及影响DNA药物药效的因素,并讨论了DNA药物的窀生,可控性等问题。