细菌科间原生质体融合的研究

本文将赖氨酸产生菌——北京棒杆菌1134株进行标记,同时将枯草芽孢杆菌BR151菌株进一步标记后,进行科间原生质体融合的探讨,揭示了科间原生质体融合的可能性。经适宜的条件培养和预处理,再在适宜的条件下,酶解制备亲本株的原生质体,用PEG(MW6000)为聚合剂,经低温短时间处理,将1134衍生株与151衍生株的原生质体进行融合;并在改良的DM_3平皿上加入适量的细胞壁碎片(作引物)与适量的人血清白蛋白制剂,使其再生,结果棒杆菌(在酶解后2.5h.)与枯草芽孢杆菌(酶解后20min)的制备率均已达到99.98％以上,再生率分别达21.3％与90.8％以上。经适温培养48h后,从融合平皿上随机挑出若干个菌落。点种于CM母平皿上,再分别影印于10套选择培养基平皿上,进行鉴定,其融合率达到了3.9×10~(-4)。从菌落形态和菌体形态上可大体分为近1134类型,近151类型和中间类型三种。经连续传代五代后,从融合子中筛选山了几株在摇床上以甜菜糖蜜为原料。产酸水平捉高近一倍的稳定高产融合子。其中Q4413株的产酸率平均达6.56％,10立升小罐发酵产酸率6.52％,糖酸转化率为40.25％,经进一步验证,该菌株的产酸能力和遗传性均是稳定的,为远缘工业微生物育种开辟了新的可行途径。     

原生质体融合选育赖氨酸高产菌种的研究

北京棒杆菌1134衍生株与枯草芽孢杆菌151衍生株的原生质体融合得到了一株可以甜菜糖蜜为原料,在摇床与小罐发酵均能稳定产赖氨酸6 50％以上的高产菌株——Q4413。Q441 3菌落形态类似于11 34株,而菌体形态区别于双亲,呈较短的杆状,无鞭毛,但有较稀疏的纤毛。生理生化研究表明：Q4413耐盐性、蔗糖发酵,石蕊牛奶试验产碱状况酷似于151株,而与1134株略有差异;运动性、糊精、柠檬酸盐利用,MR试验、酪素水解、明胶水解、石蕊牛奶还原,又酷似于1134株而区别于151株;04413的最适生长温度、pH值居双亲之间;Qq4413为原养型加三重抗性[Rifr,AECr Nalr];其细胞DNA含量与GC比测定结果均居双亲之中,而且生物量测定结果也均与双亲有一定的差异。     

芽孢杆菌原生质体融合技术

微生物原生质体融合技术是近20年来国内外细胞工程领域的一个研究热点。1972年匈牙利学者Ｆｅｒｅｎｃｚｙ率先进行了微生物原生质体融合的研究[1]。在1976年匈牙利学者Ｆｏｌｄｅｒ和Ａｌｆｏｌｄ则首次报道了用ＰＥＧ或新生态磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ)种内株间原生质体融合[2];同年法国的Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ等也用ＰＥＧ诱导枯草芽孢杆菌(Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ)进行种内株间原生质体融合获得成功[3]。有关芽孢杆菌原生质体融合的研究,在国内直至1981年才见报道[4]。经典改变微生物遗传性状的手段有两…     

硅酸盐细菌和苏云金芽孢杆菌原生质体融合

具有解钾活性的硅酸盐细菌──胶质芽孢杆菌（R．mucilaginesus）W9－12与具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌（B．thuringensis）Bt179208原生质体质进行了融合。W9－12原生质体形成率为99．7％．再生率为24．9％,Bt179208原生质体形成率为99．9％,再生率为35％。以PEG为助融剂进行原生质体融合．得到56个融合子．融合率为5．92×10－6。融合子在双抗选择培养基上连续传代10次,得到12个稳定的融合子,生物测定表明,融合子既具有一定的杀虫活性又具有一定的解钾活性。     

蛋白酶产生菌种间原生质体融合的研究

Baci llus属中的一些种是生产蛋白酶的重要菌株。 采用2500u／ml溶菌酶制备的两种芽孢杆菌原生质体在30％聚乙二醇(Mw6000)的作用下,成功地获得了枯草芽孢杆菌(Bacillusfubtilis)和地衣状芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的种间融合重组子。融合频率为7．47 x10—2．28×10-5经过四代的移接验证,融合子的稳定率达到12—20％。结果表明,两种产蛋白酶的芽孢杆菌融台后,营养缺陷和抗药特性方面可以互补;菌落形态发生某些变化;生产性能有较大的改进。     

通过原生质体融合产生的苏云金杆菌的新菌株

用苏云金杆菌以色列变种Bacillus thuuringiensis subsp.israelensis和苏云金杆菌库斯塔基变种Bacillus thuringuensis subsp.kurstaki HD-1进行了PEG诱导的原生质体融合实验,探讨了影响原生质体形的几个条件。用抗性标记对融合子进行了选择,在198株融合子中,有17株稳定传代10次以上。它们具有两个亲本菌株所具有的一些特性。在融合子中,BTI比HD-1稳定。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法研究比较了稳定融合子的晶体毒素成分,观察到了代表HD—l毒素蛋白和BTI毒素蛋白的带。杀虫试验结果表明,融合形成的杂种菌株具有毒杀文字孑孓和鳞翅目幼虫的能力。     

苏云金芽孢杆菌Bt-3701与巨大芽孢杆菌Bm-107种间原生质体融合

具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(B. thuringensis subsp kurstaki)Bt-3701与具有解磷活性的巨大芽孢杆菌(B. megaterium var. phosphaticum)Bm-107原生质体进行了融合。Bt-3701原生质体形成率为99.4％,再生率为21.4％;Bm-107原生质体形成率为97.5％,再生率为23.8％。以PEG为助融剂进行原生质体融合,得到22个融合子,融合率达6.03×10~(-3)。融合子在双抗培养基(DR-CNB)上连续传代12次,得到4个稳定的融合于生物测定表明,融合子既具有一定的杀虫活性又具有一定的解磷活性。     

双歧杆菌与乳杆菌原生质体的融合及筛选

目的：通过双歧杆菌与乳杆菌的原生质体融合构建耐氧双岐杆菌,以解决双岐杆菌制剂开发中始终存在的“活菌数低”和存活时间短等问题。方法：采用不同浓度的Mutanolysin分别制备长岐杆菌和保加利亚乳杆菌的原生质体,在电场作用下诱导长双岐杆菌原生质体和经56℃热灭活30min的保加利亚乳杆菌原生质体融合,并在双层再生培养基上筛选融合菌株。结果：成功地构建出几种较为稳定的兼具长双岐杆菌和保加利亚乳杆菌生物学特性的融合菌株;其中融合株F2具有良好的耐氧性;且能在有氧、CO2条件下良好生长。结论：通过原生质体融合技术能改良双歧杆菌的严格厌氧特性,有利于对双岐杆菌的开发和应用。     

影响枯草杆菌原生质体转化的因素

原生质体转化是将外源基因导入细菌的主要方法之一,其转化频率受制于多种因素。本研究以激BacillussubtilisDB104为宿主菌,以枯草杆菌的高表达型质粒pNQ122为外源DNA,研究了原生质体再生率、原生质体浓度和用于制备原生质体的细胞生长期对转化频率的影响,获得了在该系统中实现高频率转化的条件。该转化条件使外源基因在多个B.subtilis菌株中的转化成为可能,并使从B.subtilis中筛选中性蛋白酶基因获得成功。     

提高枯草杆菌(B.subtilis)原生质体再生率的研究(简报)

细菌原生质体制备和再生是研究细胞融合的前提条件,但关于其原生质体形成及再生的最适条件迄今尚缺乏系统的研究。再生率不高,且不稳定。本文研究了有关诸因素对供试菌株原生质体化及其活性的影响,尤其是提高再生率的措施。试验所用材料,菌株B.Subtilis Ki-2-132(Thr~-,Val~-,Ile~-,Str~+)由中国科学院遗传所赠送;溶菌酶由汉口蛋厂1981     

芽孢杆菌原生质体的形成,再生及种间融合的研究

原生质体融合技术不仅能使遗传基因高频率重组,而且可以集双亲优良遗传性状为一体.自Schaeffer等人成功地进行了微生物原生质体融合以来,这项技术便广为人们所接受.枯草芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白能抑制多种植物病原菌的生长,苏云金芽孢杆菌生成的伴孢晶体蛋白可毒杀植物害虫.利用原生质体融合技术将这两种芽孢杆菌抑菌杀虫的遗传特性融为一体,选育出防治植物病虫害的新一代生防菌株成为可能,有关这方面的研究国内外尚未见报道.本文报道了抗菌蛋白产生菌TG26-10和晶体蛋白产生菌AS1.904-17原生质体的形成,再生及种间融合的影响因素,为进一步筛选目的融合子提供基础.     

腺嘌呤对枯草杆菌GMI—971发酵生产肌苷的影响

培养基中腺嘌呤含量对腺嘌呤缺陷型的枯草杆菌GMI－971发酵产肌苷有显著影响。在拟定条件下,腺嘌呤浓度在150mg／L时摇瓶肌苷产量最高。对不同来源的四种酵母粉分别添加腺嘌呤,当其含量增加至l50ml／L时,肌苷产量也最高。     

中性蛋白酶发酵工艺优化研究

采用正交试验,对枯草芽孢杆菌ＨＤ４０１中性蛋白酶深层发酵工艺进行了优化,结果表明：较优发酵培养基为玉米粉５％、豆饼粉３％、麸皮４％、Ｎａ_２ＨＰＯ_４０．４％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．０３％;在发酵中期流加蚕蛹水解液５％、植酸钙０．２％、吐温－８００．１％,对发酵后期有较大的调控作用。采用优化工艺,在２Ｌ发酵罐中进行验证试验,酶活达１３２００ｕ／ｍｌ,比原工艺提高了１６４％。     

枯草芽孢杆菌分子克隆系统受体的改造

实验证明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BR151和MI112中的pUB110质粒,在液体中传代要比固体斜面传代稳定。通过NTG诱变获得了对pUB110稳定的受体BSG.来自大肠杆菌的穿梭质粒在BSG菌中转化频率较亲本高。小的外源DNA片段插入pBE2后在BSG菌中转管传代30次是稳定的。     

枯草杆菌中性蛋白酶天然抑制剂的筛选

用透明因法和福林──酚法筛选了２１种植物中的蛋白酶活性抑制剂,其中来自鼓皮、高粱、玉米和土豆的抑制剂的活性在本研究条件下达５０％以上。进一步研究了麸皮、玉米两种抑制剂在不同温度和ｐＨ值下的稳定性,结果表明,两者的稳定性相差甚远,是两类不同的抑制剂。玉米抑制剂比麸皮抑制剂更稳定。     

枯草芽孢杆菌在琼脂平板上进行的自然遗传转化

本文对发生在琼脂平板上的枯草芽孢杆菌自然遗传转化进行了初步的研究。结果表明,在相同条件下,该菌在琼脂平板上的自然转化率明显高于传统液体转化,并且转化反应对ＤＮａｓｅ 的抗性增强,通常被认为不能建立感受态的ＬＢ 培养物当涂布到平板上后也很快具有了自然转化的能力,说明在固相物表面进行的转化过程与传统的液体法存在一定的差异。在琼脂平板上,也能观察到具不同遗传标记的菌株间进行的细胞间自然转化。     

枯草芽孢杆菌中怀植酸酶的纯化和酶学性质

从土壤中分离到了产中性植酸酶的枯草芽孢杆菌菌株并对所产植酸酶进行了分离纯化,此中性植酸酶的反应最适pH为7．5,最适温度为55度,在37度下以植酸钠为底物的Km值为0．19mmol/L,植酸酶活性依赖Ca^2 的存在,酶蛋白的分子量大小约为45kD,纯酶蛋白N端序列为Lys-His-Lys-Leu-Ser-Asp-Pro-Tyr-His-Phe-Thr。     

壳聚糖固定化AS1．398中性蛋白酶稳定性的研究

对以壳聚糖为载体,由戊二醛作交联剂。制备的固定化ＡＳ１．３９８中性蛋白酶的稳定性进行了研究。实验结果表明,固定化ＡＳ１．３９８中性蛋白酶对热、乙醇、尿素以及ｐＨ值的稳定性均有明显的提高。     

提高人工繁殖大熊猫的存活率初探

1963年～ 1 997年 4月 ,圈养条件下国内外共繁殖了大熊猫 1 1 9胎 1 79仔 ;其中成活至半岁以上的占初生仔数的 44 1 0 % ,成活至 2 5岁的占 30 43 % ,而成活至 3岁以上的仅占 2 1 1 1 % [1 ] ;人工繁殖大熊猫的成活率低 ,充分表明了大熊猫配种难、妊娠难、存活更难的情况。人工授精取得成功为缓解大熊猫的配种难提供了科学的方法。如何提高人工繁殖大熊猫的存活率 ,特别是进一步提高断奶后幼仔及亚成体的存活率 ,让人工繁殖的大熊猫更多地参加到繁殖种群中 ,是我国有关科研工作者目前的重要研究课题。1 991年～ 1 996年 ,成功繁殖了大熊…