将抗真菌病基因导入马铃薯的研究

实验采用微束激光穿刺技术和农杆菌介导方法,将携带有Ⅰ型烟草β－１,３－葡聚糖酶基因和Ⅰ型菜豆几丁质酶基因的ｐＢＬＧＣ质粒导入马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）品种“津引８号”。微束激光穿刺技术转化中,获得了７株卡那霉素抗性再生苗,分子检测证明,其中有１株为菜豆几丁质酶基因单基因转化植株。在农杆菌介导方法中得到了１３株卡那霉素抗性再生苗,其中有３株为烟草β－１,３－葡聚糖酶基因单基因     

拟南芥未知功能基因At3g61870编码蛋白的叶绿体定位研究

利用反向遗传学研究方法对1个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At3g61870编码蛋白进行了亚细胞定位研究.通过克隆At3g61870基因5′端长229 bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-CP-TP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥.转基因植株的叶肉细胞经激光共聚焦显微镜观察,叶绿素自发荧光与GFP荧光共定位于叶绿体中.结果表明,未知功能基因At3g61870编码的蛋白质为叶绿体蛋白质.     

定点整合抗虫基因到油菜叶绿体基因组并获得转基因植株

以基因枪法进行了油菜叶绿体基因组的定点转化,载体pNRAB携带抗壮观霉素的筛选标记基因aadA和抗虫基因cry1Aα10,基因的两侧被添加了可用于同源重组的叶绿体DNA序列,基因枪轰击过的油菜子叶柄经植株再生和壮观霉素筛选,获得了36株抗性植株,PCR检测和Southern杂交显示,其中4株的叶绿体基因组已被转化,外源基因已被定点整合进叶绿体基因组的rps7和ndhB基因之间。用转基因植株的叶片饲喂二龄小菜蛾,1周后幼虫死亡率达33%-47%,存活幼虫的生长明显减慢,转基因油菜的叶片受害较轻。     

激光微束诱导pSV—β质粒导入Hela细胞的研究

本文报道了用一套Ｎｄ：ＹＡＧ紫外激光微束系统研究基因转移。我们以ｐＳＶ－β质粒（β－半乳糖甙酶基因）作为报道基因,利用外激光微束将其导入Ｈｅｌａ细胞中,通过组织化学染色检测到质粒在Ｈｅｌａ细胞中获得表达,在最佳的激光辐照条件下,Ｈｅｌａ细胞的导入表达成功率在８０％以上。本工作是国内首次报道激光微束诱导外源基因进入动物细胞中获得表达,为激光微束技术在动、植物细胞高效率导入外源ＤＮＡ的研究中摸索到一套     

利用微束激光穿刺法将抗真菌基因导入棉花的研究初报

以棉花感受态萌动种胚作为外源基因转化的受体,用激光微束穿刺法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pB IBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因。激光转化处理的种胚经卡那霉素筛选,已经获得抗性小植株。研究了微束激光转化法用于棉花感受态萌动胚转化预培养的时间、高渗液对材料的处理等。研究表明:用微束激光转化处理种胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入植物感受态萌动胚,避开植株离体再生的困难。     

油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建

根据已知序列设计引物,通过PCR扩增获得质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因序列。先将该酶4个亚基的基因进行拼接,然后将这4个拼接好的片段,克隆到pMD18-T载体上,得到质粒pH BM714。再以质粒pHBM714 DNA为模板,用分别带有CpoI和Asc I酶切位点的引物进行PCR扩增,PCR产物在dTTP的保护下经T4 DNA聚合酶处理,与将质粒pHBM720DNA纯化后经CpoI和AscI双酶切后得到的大片段连接,连接产物转化大肠杆菌Xl_(10)-gold,得到正确的重组子命名为pHBM726。此质粒pH BM726,即为带有壮观霉素抗性基因(aadA)筛选标记的质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因油菜叶绿体单交换表达载体;在此载体中壮观霉素抗性基因(aadA)、乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因(ACC)和绿色荧光蛋白基因(gfp)共6个基因串联在一起,共用一个启动子序列,一起来进行表达;通过酶切检测、PCR验证和测序验证,均表明该表达载体构建成功。最后此载体在大肠杆菌中表达时,发现重组菌能够在含壮观霉素的培养基上生长,且在可见光下,能看到绿色荧光,表明壮观霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因均在大肠杆菌中成功表达;表达产物通过Western印迹验证表明组成乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因在大肠杆菌中成功表达。以上结果表明,该表达载体中串联排列的这6个基因均在大肠杆菌中成功表达。该研究结果可为质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转叶绿体的研究奠定基础,为油菜油脂代谢研究提供参考。     

激光微束诱导pSV－β质粒导入Hela细胞的研究

本文报道了用一套Ｎｄ：ＹＡＧ紫外激光微束系统研究基因转移。我们以ｐＳＶ－β质粒（β─半乳糖苷酶基因）作为报道基因,利用紫外激光微束将其导入Ｈｅｌａ细胞中,通过组织化学染色检测到质粒在Ｈｅｌａ细胞中获得表达,在最佳的激光辎照条件下,Ｈｅｌａ细胞的导入表达成功率在８０％以上。本工作是国内首次报道激光微束诱导外源基因进入动物细胞中并获得表达,为激光微束技术在动、植物细胞高效率导入外源ＤＮＡ的研究中摸索到一套经验,也将有力地促进这一技术在细胞工程方面的应用。     

用激光微束法将外源基因导人水稻细胞的研究

将外源基因导入植物细胞是植物基因工程的关键步骤之一。用激光微束技术转化动物细胞已经取得了成功,并证明外源基因已整合到细胞染色体上。最近又证明激光微束可穿透植物细胞壁和细胞膜,将pBR322DNA导入植物细胞和细胞器。本实验在利用激光微束技术将外源基因导入水稻培养细胞上进行了探索。 所用外源DNA是pBI121质粒,该质粒带有CaMV35启动子和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因,用     

利用激光微束穿刺法将杀虫蛋白基因导入油菜的研究

利用激光微束照射油菜子叶柄,将来自苏云金杆菌的杀虫蛋白（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｃｒｙｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ,ＩＣＰ）基因导入油菜细胞中,经植株再生和卡那霉素筛选,获得了转基因植株。对转基因植株进行了ＰＣＲ检测和饲虫实验,发现转基因植株为ＰＣＲ扩增阳性,某些植株表现出了较强的抗虫性。实验结果表明外源抗虫基因已被整合到油菜基因组并得到了表达。     

利用激光微束穿刺法将外源基因导入小麦的研究

用激光微束穿刺法将携带有新霉素磷酸转移酶（ＮＰＴ－Ⅱ）基因的质粒ｐＪＩＴ１０１导入京花１号小麦幼胚细胞。方法是将小麦幼胚细胞进行高渗缓冲液预处理,用微米级的激光微束处理,然后在卡那霉素培养基上筛选出具抗性的愈伤组织及绿色小植株。第一年,从１５０个小麦幼胚中,在卡那霉素培养基上筛选出４株绿苗,取两株进行ＮＰＴ－Ⅱ酶活性分析,测到了ＮＰＴ－Ⅱ酶的活性。第二年重复实验,从２４５个小麦幼胚中,经筛选获得１株绿苗,进行了叶片ＤＮＡＰＣＲ扩增检测,转化的绿色小苗扩增出所导入的ＮＰＴ－Ⅱ基因编码的片段。结果表明,外源ＮＰＴ－Ⅱ基因已导入了小麦,并实现了整合表达。     

拟南芥未知功能基因At4g22890编码蛋白的叶绿体定位

蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察,GFP荧光仅在叶绿体中观察到,表明所克隆的DNA序列编码的多肽能够将At4g22890编码蛋白质引导进入叶绿体,由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。     

两种裸藻的无叶绿体突变株

利用Ofloxacin处理获得了纤细裸藻和中型裸藻无叶绿体突变株。吸收光谱测定和自荧光显微观察证明突变株无叶绿素合成,DAPI染色方法显示突变株细胞不存在质体DNA,而无色的长变胞藻细胞中仍有可检测质体DNA,说明二突变株质体已消失。SDS－PAGE显示野生种和突变株各有特异蛋白表达。     

激光微束切割小冰麦异附加系染色体的研究

利用激光微束,并选用适当的功率密度可将小冰麦异附加系花粉细胞染色体切割成2～3个片段,这个技术的建立为激光微束应用于染色体片段DNA微克隆及基因定位提供可能。     

拟南芥未知功能基因At4g22890 编码蛋白的叶绿体定位

蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890 编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208 bp 的DNA 片段, 与绿色荧光蛋白(GFP) 基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP, 经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察, GFP 荧光仅在叶绿体中观察到, 表明所克隆的DNA 序列编码的多肽能够将At4g22890 编码蛋白质引导进入叶绿体, 由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。     

用一种新型基因枪将外源基因转入水稻细胞(简报)(英文)

本文介绍了一种设计上改进的基因枪,用这种新型基因枪将外源基因转移到水稻细胞获得了表达。用包有pBI 121质粒DNA的钨微弹轰击水稻悬浮细胞以及成熟种子胚后,在悬浮细胞中检测到了外源基因(GUS)的表达。胚诱导的愈伤组织在无抗生素选择的条件下扩增并分化、再生,共获得30株绿色小植株。经DNA斑点杂交测得其中两株的植物总DNA中存在GUS基因。Southern杂交分析证实GUS基因整合到了水稻基因组.     

激光微束技术及其在基因转移研究中的应用

本文中介绍了我们设计和安装的一套激光微束系统,该系统分为二部份:激光源和显微镜.工作波长355nm是由电子调Q Nd:YAG激光经KDP倍频和混频后得到的.这束光从显微镜的左边引入45°反射,再经×100物镜聚焦.光束直径小于1μ.这束激光可给细胞打孔,约在1秒内小孔自行修复,在修复之前荧光物质和质粒可以扩散进细胞.我们成功地把GUS基因导入烟草花粉细胞中并得到瞬间表述,还把DAPI-λDNA导入M85胃癌细胞必观察到兰色荧光.从本工作初步表明这种导入方法很有发展前途.     

油菜BnCr4基因RNAi载体构建及植株转化

该实验构建了含甘蓝型油菜黄化相关基因BnCr4特异片段反向重复结构的RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Cr4,通过根癌农杆菌介导转化油菜,获得47株抗Basta的抗性再生油菜植株,其中10株经PCR鉴定为阳性转基因植株.随机选取3株经鉴定的转基因阳性油菜植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示,相对于非转基因的野生型油菜,3株转基因植株中BnCr4基因的表达量分别降低了78.5%、8.5%、11.8%,表明该干扰载体转入油菜能特异引起植株BnCr4基因表达量下降.     

甘蓝型油菜PEP基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建及转基因油菜的获得

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个种子的含油量.本研究利用PCR法从甘蓝型油菜花油5号(H045)克隆了PEP基因片段,并与载体pBI121-B构建了反义PEP基因的种子特异性植物表达载体,通过激光微束穿刺法将其转化到甘蓝型油菜中,目前已获得了转基因植株.     

细胞结构的显微操作

西德的马科斯-普朗克细胞生物学研究所和海德堡大学的G.Weber等人报道了激光微光束在显微操作以及通过细胞壁和质膜把外源DNA引入完整的芸苔细胞和小孢子中的应用。此外,他们还使用激光脉冲穿孔,把DNA导入细胞叶绿体中,然后分析同步细胞的后期板极中的染色体。荷兰ITAL研究所和Weizman科学院的H.A.Verhoeven等人使用微注射法把一种烟草原生质体中的叶绿体转入另一种烟草原生质体中。其总成活率为30％。50次成功注射     

水稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其在玉米中的功能验证

以水稻基因组DNA为模板,用PCR方法克隆了水稻谷蛋白基因G t1的启动子序列,并将其构建到带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物表达载体上,用微束激光穿刺法转化玉米的受体组织,通过外源基因瞬时表达的方法验证了该启动子的功能,结果表明在胚乳中有较强的表达,而在其它组织中表达很弱;证明了水稻谷蛋白基因G t1的启动子在不同物种玉米中同样具有胚乳特异表达的功能。为这一胚乳特异启动子的广泛利用提供了理论依据。