诺如病毒NV衣壳蛋白VP1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的获得纯化的诺如病毒(NV)衣壳蛋白VP1,免疫动物制备多克隆抗体。方法提取粪便样品中诺如病毒RNA,逆转录得到cDNA文库,通过PCR扩增获取VP1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中诱导表达重组VP1蛋白。使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的VP1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价、Western blot检测抗体特异性。结果成功地构建出重组表达载体VP1-pET28a,并将其在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定地表达诱导重组蛋白。ELISA测其多抗血清的平均效价为1∶200 000,Western blot检测抗体在原核和真核特异性很高。结论本实验成功地利用原核表达系统表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,为进一步研究诺如病毒的诊断和疫苗开发提供了条件。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a(+) 中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1.将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达.该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清.以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上.以Western blot 检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性.VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础.     

Carboxin抗性基因(Cbx~R)原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]克隆CbxR基因,进行原核表达,纯化CbxR基因蛋白并制备其多克隆抗体。[方法]CbxR基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达并纯化,Western blot鉴定分析。制备CbxR蛋白的兔源多克隆抗体,运用间接ELISA方法检测多抗效价,利用Western blot印记检测抗体特异性。[结果]成功获得CbxR基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量表达,成功制备CbxR蛋白兔源多克隆抗体,效价为1∶64 000,经Western blot检测表明多克隆抗体特异性良好。[结论]多克隆抗体为CbxR检测及进一步研究CbxR基因功能奠定了基础。     

人细小病毒B19 VP1u多克隆抗体的制备及其保守区外N端氨基酸对sPLA2活性影响的初步研究

【目的】制备人细小病毒B19-VP1u的多克隆抗体,探究VP1u多克隆抗体及其保守区外N端氨基酸对病毒磷脂酶A2活性的影响。【方法】首先通过分子克隆方法构建相应原核表达载体;利用原核表达系统纯化含MBP标签的VP1u全长及N端系列截短突变融合蛋白;接着免疫新西兰大白兔制备全长VP1u蛋白的多克隆抗体;最后利用磷脂酶A2活性检测试剂盒检测了纯化蛋白的磷脂酶A2活性。【结果】Western blot及免疫荧光实验证实制备的多克隆抗体具有较高的特异性;磷脂酶A2活性检测发现全长VP1u-MBP融合蛋白具有一定的活性,该活性可以被VP1u的抗体抑制;N端保守区外截短系列蛋白的酶活检测发现,N端截掉12个氨基酸时酶活降低53%,截掉67个氨基酸时酶活性几乎完全丧失。【结论】首次发现VP1u保守区外N端氨基酸,尤其是第12个氨基酸前的区域以及第22-67个氨基酸之间的区域,对sPLA2活性的保持具有重要意义,推测该区域可能对维持正常的蛋白构象起重要的作用;而其特异性多克隆抗体的制备也为进一步研究B19病毒VP1u在病毒复制周期的作用奠定基础。     

甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 EGF片段多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MBL-associated serine protease-2,MASP-2)EGF功能区蛋白的多克隆抗体并进行鉴定,为后续研究奠定基础。方法利用带有EGF基因片段的p GEX-6P-2原核载体诱导表达GST-EGF融合蛋白,并采用商品化GST-Beads进行纯化;将纯化的融合蛋白作为抗原,与弗氏完全佐剂充分混合后,免疫5周龄BALB/c雌性健康小鼠,制备多克隆抗体;利用琼脂双扩散法检测多克隆抗体的效价,并进一步应用Western blot鉴定多克隆抗体的特异性及效价。结果成功表达并纯化EGF蛋白,以此成功制备出特异性强的GST-EGF融合蛋白的多克隆抗体,与其他蛋白无交叉反应;琼脂双扩散法检测的EGF抗体效价为1∶8;Western blot检测的EGF抗体效价大于1∶2 000。结论成功制备出具有特异性强且效价高的GST-EGF蛋白的多克隆抗体。     

粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了p ET-28a(+)-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6×His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。     

人PD1胞外须基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的：研究人PD1的生物学活性,制备人PD1胞外段区域及其特异性抗体。方法：用PCR方法扩增编码人PD1胞外段的基因序列（hPD1ecr）,将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定。纯化目的蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）,流式细胞术检测抗体滴度及其特异性。结果：原核表达载体pET28a（＋）-PD1ecr成功构建,并可在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,得到的PD1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论：得到纯化的人PD1胞外蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下人PD1蛋白,为进一步研究PD1功能奠定了实验基础。     

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ, GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示, VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD; Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1:10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中, VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛...     

重组甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白的纯化及其多克隆抗体制备

目的：制备可用于甘蔗花叶病毒（ScMV）E株系（ScMV-E）检测用多克隆抗体。方法：将ScMV-E外壳蛋白（CP）基因连接到pET29a（＋）上,经PCR检测、酶切及测序鉴定获得重组质粒pET29a-CP,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组ScMV-E外壳蛋白;采用His Trap Kit纯化目的蛋白,作为抗原免疫新西兰大白兔,制备特异性抗体;通过间接ELISA、Western blot和组织印迹法检测所制备抗体的特异性。结果：SDS-PAGE分析表明,重组融合蛋白含6个组氨酸标记,相对分子质量约43000;Western blot检测显示所获得的抗体特异性良好,间接ELISA法测得血清的效价为1：81 920;甘蔗叶片的组织印迹检测结果显示杂交效果良好。结论：制备的多克隆抗体可直接用于ScMV-E检测,并有望用于制备ScMV-E检测试剂盒。     

灰飞虱内生病毒HiPV外壳蛋白VP1多克隆抗体的制备及在病毒检测中的应用

【目的】前期发现水稻条纹病毒(rice stripe virus, RSV)可与介体灰飞虱Laodelphax striatellus体内的HiPV病毒(Himetobi P virus, HiPV)互作。本研究旨在制备HiPV外壳蛋白VP1的多克隆抗体,并评估其在HiPV病毒检测中的可用性,以为深入研究HiPV-RSV和HiPV-灰飞虱的互作机制提供技术支持。【方法】以RT-PCR方法从灰飞虱成虫体内扩增HiPV主要外壳蛋白基因VP1,然后将VP1基因亚克隆至原核表达载体pET-32a中,构建表达载体pET-VP1。将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3),经IPTG诱导、Ni²⁺-NTA亲和层析纯化,获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,制备抗体。【结果】从灰飞虱体内克隆到774 bp的HiPV外壳蛋白基因VP1,经原核表达、纯化,获得分子量约47.5 kD的融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得VP1多克隆抗体。该抗体间接ELISA效价达1∶819 200,与HiPV外壳蛋白VP1有特异性反应,而与灰飞虱蛋白无交叉反应。利用该多克隆抗体建立了检测单头灰飞虱成虫体内HiPV的Western blot和免疫捕获RT-PCR方法,检测结果显示HiPV在携带和不携带RSV的灰飞虱高亲和性群体内均广泛存在。【结论】利用制备的HiPV的VP1多克隆抗体可特异性检测灰飞虱体内HiPV。本研究为HiPV病毒的快速检测以及HiPV-RSV互作、HiPV-灰飞虱互作研究提供了技术支持。     

传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

Prokaryotic expression of chicken infectious anemia apoptin protein and characterization of its polyclonal antibodies

In the present study recombinant VP3 (rVP3) was expressed in E. coli BL21 (DE3) (pLysS) and its polyclonal antibodies were characterized. SDS-PAGE analysis revealed that the expression of recombinant protein was maximum when induced with 1.5 mM IPTG for 6 h at 37 degrees C. The 6xHis-tagged fusion protein was purified on Ni-NTA and confirmed by Western blot using CAV specific antiserum. Rabbits were immunized with purified rVP3 to raise anti-VP3 polyclonal antibodies. Polyclonal serum was tested for specificity and used for confirming expression of VP3 in HeLa cells transfected with pcDNA.cav.vp3 by indirect fluorescent antibody test (IFAT), flow cytometry and Western blot. Available purified rVP3 and polyclonal antibodies against VP3 may be useful to understand its functions which may lead to application of VP3 in cancer therapeutics.     

草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒NS66抗体制备及应用

[背景]草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV genotypeⅢ) 104株可导致典型性草鱼出血病,对其编码片段的分析有望为临床免疫学检测提供依据。[目的]研究GCRV104株s6基因节段编码蛋白NS66的可能功能,制备良好的GCRV104株NS66蛋白多克隆抗体并分析其特异性。[方法]PCR方法扩增GCRV104株s6基因片段,并克隆至表达载体pGEX-4T-3,转化到大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达,其产物经SDS-PAGE鉴定分析后,通过纯化获得目的蛋白。然后用纯化的pGEX-4T-3-NS66重组蛋白免疫小鼠,获得Anti pGEX-4T-3-NS66多克隆抗体,Western blot测定抗体效价,Western blotting和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定抗体特异性。[结果]SDS-PAGE分析显示表达的重组蛋白约66 kD,大小与预期相符,主要存在于包涵体中;Western blotting测得制备的多克隆抗体效价大于1:50 000,Western blotting和IFA结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别GCRV104病毒。[结论]GCRV104病毒编码的非结构蛋白NS66可能参与了复制和组装过程,形成病毒包涵体,这为建立GCRV104免疫诊断方法及研究GCRV编码的NS66蛋白的功能奠定了前期基础。     

新型α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的：制备高效价、高特异性的新型α-半乳糖苷酶的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法：用脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫新西兰大白兔,获得α-半乳糖苷酶的兔抗血清,并经HiTrap rProteinA柱纯化获得高纯度的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹评价抗体的特异性。结果：通过免疫法得到了α-半乳糖苷酶的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1：1×10^6,经rProteinA柱纯化后获得了高效价、高纯度的抗体,Western印迹显示该抗体特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合。结论：获得了新型α-半乳糖苷酶的高效价、高特异性的兔多克隆抗体,可用于血型转变过程中残留α-半乳糖苷酶含量的特异性检测。     

果蝇凋亡蛋白Strica的原核表达、多克隆抗体的制备及在放线菌酮诱导下的激活状态检测

【目的】细胞凋亡是真核生物中保守的细胞程序化死亡,由蛋白酶caspase介导。Strica是果蝇Drosophila中一个特殊的caspase,至今未有其商品化抗体且生化功能未知。本研究旨在通过克隆、原核表达纯化果蝇Strica蛋白并制备其多克隆抗体来初步研究其功能。【方法】根据果蝇Strica的基因序列构建原核表达载体并转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞,表达Strica蛋白;将表达纯化后的Strica蛋白免疫家兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA和Western blot分别测定抗体效价和灵敏度;利用前期构建的过表达载体pAc5-V5-Strica进行转染果蝇S2细胞,设计合成siRNA进行RNAi验证该抗体的特异性;利用该抗体通过免疫荧光实验检测Strica在果蝇S2细胞中的亚细胞定位;利用该抗体通过Western blot实验探究放线菌酮(10 μg/mL)处理后果蝇S2细胞中Strica蛋白的激活状态。【结果】获得了果蝇Strica重组蛋白;ELISA检测Strica抗体的效价大于1∶25 600;Western blot鉴定该抗体在1∶10 000的稀释度下能与重组蛋白反应;该抗体可以检测到S2细胞中过表达以及内源性Strica蛋白;Strica蛋白在S2细胞质中呈现散点分布;放线菌酮介导Strica蛋白的切割激活。【结论】成功制备了兔抗果蝇Strica多克隆抗体。Strica响应凋亡刺激物放线菌酮激活,推测Strica参与果蝇的细胞凋亡过程。本研究为进一步深入研究Strica的功能奠定了实验基础。     

小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。     

兔抗金黄地鼠酶标抗体的制备及应用

目的 纯化金黄地鼠血清IgG,制备兔抗金黄地鼠酶标抗体(IgG-HRP),开展金黄地鼠仙台病毒的初步检测.方法 采用亲和层析纯化法纯化金黄地鼠IgG,用SDS- PAGE电泳测定IgG纯度并制备兔抗金黄地鼠IgG抗体(second antibody,Ab2);用免疫双扩散法检测抗血清效价后,再用亲和层析纯化抗血清IgG( Ab2);采用改良过碘酸钠标记法制备兔抗金黄地鼠酶标抗体( rabbit anti-hamster IgG-HRP);用直接ELISA和Western-blot法对兔抗金黄地鼠IgG酶标抗体进行工作浓度测定;应用金黄地鼠酶标抗体对金黄地鼠仙台病毒进行酶免检测(IEA).结果 金黄地鼠血清IgG纯度达95％;兔抗金黄地鼠IgG抗体(Ab2)免疫双扩散效价为1(:)64;兔抗金黄地鼠IgG -HRP经直接ELISA和Western-Blot测定工作浓度分别为1∶5000和1∶2000;酶免(IEA)效价为1:2000.结论 高效快速纯化了金黄地鼠IgG,制备了金黄地鼠IgG-HRP,为金黄地鼠病原微生物的血清学检测提供了条件.     

凋亡素蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价

凋亡素由鸡贫血病毒中的VP3基因编码,能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。以真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,最终纯化后的抗体效价可以达到1 ∶ 243 000。用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染细胞后对抗体的特异性进行免疫学评价。首先利用免疫荧光技术检测VP3基因在人膀胱癌细胞株T24、EJ细胞以及Vero细胞中的表达情况,观察到凋亡素在T24、EJ细胞中主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质。其次通过Western blotting检测纯化后的抗体能与细胞内腺相关病毒介导表达的凋亡素蛋白特异性结合。实验证明了制备的凋亡素蛋白多克隆抗体的有效性和特异性,为进一步阐明凋亡素抗肿瘤效应的分子机制及生物学特性奠定了基础。