u-PA/t-PA嵌合型纤溶酶原激活剂(ut-PA)的构建、表达、纯化和性质研究

将尿激酶原（ｐｒｏ－ＵＫ）ｃＤＮＡ和组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）Ａ链ｃＤＮＡ克隆到Ｍ１３ｍｐ１８中,经过二次寡核甘酸诱导的大片段定点删除和一次寡核苷酸诱导的多位点突变,得到ｕ－ＰＡ（Ｌｅｕ１４４－Ｇｌｙ４０８）／ｔ－ＰＡ（Ｓｅｒ１－Ｔｈｒ２６３）（ｕｔ－ＰＡ）融合基因．将ｕｔ－ＰＡ融合基因克隆到表达载体ｐＣＭ－βｎｅｏ中,与ｐＣＭ－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－细胞,筛选稳定表达株．收集无血清表达上清,经苯甲脒柱纯化得到ｕｔ－ＰＡ纯品,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和纤维蛋白自显影显示ｕｔ－ＰＡ有两种分子量形式,分子量分别为６８ｋＤ和６１ｋＤ．纤维蛋白亲和性试验表明,ＬＵＫ（低分子量尿激酶）对纤维蛋白没有亲和性,而含有ＬＵＫ的ｕｔ－ＰＡ则对纤维蛋白表现出很强的亲和性,但ｕｔ－ＰＡ的亲和性略低于亲本ｔ－ＰＡ．     

凝血酶激活的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的构建、表达、纯化和性质研究

用Ｋｕｎｋｅｌ突变法,将单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｓｃｕ－ＰＡ）ｃＤＮＡ基因中编码Ｐｒｏ１５５—Ｌｙｓ１５８的片段定点突变,并将此突变的ｓｃｕ－ＰＡ（ｔｓｃｕ－ＰＡ）的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣＭ－β－ｎｅｏ中,与ｐＣＭ－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－细胞．获得的稳定表达株在无血清培养基中２４ｈ的表达量为６２０ＩＵ／１０６细胞．经锌离子螯合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析得到ｔｓｃｕ－ＰＡ纯品．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示ｔｓｃｕ－ＰＡ分子量为５３ｋＤ左右,与预期的结果相符．ｔｓｃｕ－ＰＡ是由凝血酶激活而不是由纤溶酶激活,但激活后也能转变为双链分子（ｔｃｕ－ＰＡ）．ｔｓｃｕ－ＰＡ仍保持了ｓｃｕ－ＰＡ的血纤维蛋白亲和性．酶动力学研究表明,激活后的ｔｓｃｕ－ＰＡ水解Ｓ２４４４的Ｋｍ和Ｋｃａｔ值与高分子量尿激酶（ＨＵＫ）相似．体外溶栓实验结果表明,ｔｓｃｕ－ＰＡ可以选择性地溶解富含凝血酶的血凝块,对贫凝血酶的血凝块作用不大     

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳纤维蛋白自显影法检测不同分子量的纤溶酶原激活剂

ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）纤维蛋白显影方法是经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ将不同分子量的纤溶酶原激活剂（ＰＡ）分开,然后再转溶纤维蛋白板使之产生溶带而检测ＰＡ物质活性及分子大小的方法。此法与Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法比具有检测更简便、灵敏、快速的特点,且是活性检测,但其分子量分析精度不如Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。本研究用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纤维蛋白自显影方法对本室表达的重组组织型－ｐＡ（ｒｔ－ＰＡ）及突变体Ｎｌｌ７Ｑ／Ｎｌ８４Ｑ／△（Ｋ２９６——Ｇ３０２）及标准尿激酶（ＵＫ）和ｒｔ－ＰＡ进行了分析鉴定。     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．     

尿激酶抗人交联纤维蛋白-D-二聚体单抗化学偶合体的制备

利用双功能试剂Ｎ－琥珀酰亚胺－３（２－二硫吡啶）丙酸酯（ＳＰＤＰ）作交联剂,合成了尿激酶（ＵＫ）－抗人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体单抗（ＭＡ－ＨＩＤ１）化学偶合体（ＵＫＭＡ－ＨＩＤ１）,并用苯甲脒－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ及人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱纯化,获得偶合体产物．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ呈现一条带,其分子量约为２０００００．纤维蛋白平板法测活结果显示,偶合体中酶比活为５３０００ＩＵ／ｍｇ尿激酶蛋白,与偶联前的５４３００ＩＵ／ｍｇ蛋白相仿．ＥＬＩＳＡ测试显示,偶合体对人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体有免疫反应性,并且与偶联前的抗Ｄ－二聚体单抗对此抗原的反应性相当     

人胎肺细胞的条件化培养液中两种类型纤溶酶原活化物的分离

用正常人胎肺细胞体外培养,从其培养液中分离纤溶酶原活化物（ＰＡ）,通过ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０层析,硫酸铵沉淀和Ｆｉｂｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ,Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤等步骤,从１０．５ｌ条件培养液中分离纯化得到两种类型的纤溶酶原活化物,ｔ－ＰＡ９０μｇ,ｕ－ＰＡ８００μｇ．在还原条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥ均显示单带,分子量ｔ－ＰＡ为７２ｋＤ,ｕ－ＰＡ为５４ｋＤ,纤溶比活分别为１５６０００ＩＵ／ｍｇ蛋白和１０６０００ＩＵ／ｍｇ蛋白．     

可溶性55kD人肿瘤坏死因子受体(shTNFR55)在变铅青链霉菌中的分泌表达

从 Ｈｅ Ｌａ 细胞中提取总 Ｒ Ｎ Ａ,采用反转录 Ｐ Ｃ Ｒ 技术,从该总 Ｒ Ｎ Ａ 中扩增了约 ５３０ ｂｐ 的ｓｈ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 基因的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ,并克隆至质粒 ｐ Ｕ Ｃ ｍ ｅｌ中酪蛋白酶 ｍ ｅｌ Ｃｌ 分泌信号肽编码序列的下游,构建成含融合基因 ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 的重组质粒 ｐ Ｕ Ｃ ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ．把融合基因 ｍ ｅｌ／ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 插入链霉菌表达质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ 的多克隆位点,使之位于 ｅｒｍ 强启动子的下游,得到重组表达质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ．经 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交证明重组质粒 ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ 插入了 ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 基因片段．对重组菌株 Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（ｐ Ｉ Ｊ４５９ ｍ ｅｌ／ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ）的发酵液进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、受体配基杂交（ Ｌｉｇａｎｄ ｂｌｏｔ）分析、对 Ｔ Ｎ Ｆ 敏感的 Ｌ９２９ 细胞的细胞毒性中和试验表明,可溶性肿瘤坏死因子受体 ｓ Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ５５ 在链霉菌中得到了分泌表达,表达产物具有生物学活性．表达产物的分子量约在 ２６～２８ ｋ Ｄ 之间．     

重组人尿激酶原的分离纯化及性质研究

本文报道从人尿激酶原（ｐｒｏ－ｕｒｏｋｉｎａｓｅ,ｐｒｏ－ＵＫ）基因重组工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＡ２２１表达产物的复性液中纯化尿激酶原的方法。复性产物经Ｚｎ＾２＋选择性沉淀,尿激酶抗体亲和柱层析,ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ４Ｂ亲和吸附,即得比活达１１００００ＩＵ／ｍｇ的纯化产品。样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,在还原及非还原条件下,均表现为分子量为４３ｋｄ的单一条带。动力学研究测得     

GPRP－scu－PA（144－411）的基因构建及其性质研究

本文将人工合成的编码ＧＰＲＰ四肽的亥核苷酸序列连接至ｓｃｕ－ＰＡ（１４４－４１１）ｃＤＮＡ的５’端,并将它重组克隆到表达载体ｐＫＫ２３３－２中,在大肠杆菌中得到５％的表达量。表达产物经亲和层析得到纯化,并测得其Ｋｍ为４０ｍｏｌ／Ｌ。体外纤溶效率为ＬＵＫ的２－３倍,对纤维蛋白的亲和性比ＬＵＫ提高了６倍,并且对纤维蛋白原的亲和力很低。以上结果表明ＧＰＲＰ四肽可以提高尿激酶对纤维蛋白的专一亲和性。     

高分子量和低分子量尿激酶的分离纯化及动力学性质研究

人尿激酶粗品经苯甲脒亲和柱纯化和Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＰａｋＳＰ柱分离后,得到两种分子量的尿激酶（ＵＫ）,即高分子量尿激酶（ＨＵＫ）和低分子量尿激酶（ＬＵＫ）,采用民斯亮蓝法测定蛋白质浓度,纤维蛋白板法测定活力,测得ＨＵＫ比活为２．９×１０＾５ＩＵ／ｍｇ蛋白,ＬＵＫ为３．５１０＾５ＩＵ／ｍｇ蛋白,活力回收为７０％以上,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,ＨＵＫ和ＬＵＫ均呈单一条带,分子量分别为５４ｋＤ和３３ｋＤ,Ｈ     

重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原导向溶栓剂的基因构建及表达

为了获得特异性高的导向溶栓药物,应用PCR技术,得到抗人活化血小板单抗(SZ-51)的Fab′基因片段。再用酶切方法,将Fab′中CH1基因片段替换成合成的连接分子(linker)基因,构建成单链抗体基因,并插入到人尿激酶原分泌肽基因及低分子量单链尿激酶(scu-PA-32k)之间,最终构建成重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原融合蛋白基因。此融合蛋白基因在昆虫细胞中得到表达。纯化的表达产物SDS-PAGE鉴定,其分子量约为60kD,与预期值相符。其比活为9000IU/mg蛋白。ELISA法初步证明此重组的融合蛋白具有与活化血小板抗原结合特异性。     

ut-PA抗PAI-1突变体的构建及在sf-9细胞中的表达

为使嵌合分子 ut- PA获得抗 PAI- 1抑制作用的性质 ,将删除了编码 u- PA中 R1 78- R1 79-H1 80 - R1 81的 1 2个核苷酸的 u- PA c DNA[u- PA( 1 ) ]的 Bam H - Eco R 部分酶切片段 ,克隆到含嵌合蛋白 ut- PA基因的转移载体 p VL 1 392 - ut- PA的相应位点中 ,构建了一个含有新的嵌合蛋白基因 ut- PA( 1 )的转移表达载体 p VL1 392 - ut- PA( 1 ) .在昆虫病毒表达系统 sf- 9细胞中表达该嵌合蛋白基因 ,表达上清具有纤溶性 ,用血纤维蛋白平板法和 S2 4 44 显色底物法分别测得活力为 2 4 8IU/ml和 380 IU/ml     

ut-PA抗PAI-1突变体的构建及在sf-9细胞中的表达

为使嵌合分子 ut- PA获得抗 PAI- 1抑制作用的性质 ,将删除了编码 u- PA中 R1 78- R1 79-H1 80 - R1 81的 1 2个核苷酸的 u- PA c DNA[u- PA( 1 ) ]的 Bam H - Eco R 部分酶切片段 ,克隆到含嵌合蛋白 ut- PA基因的转移载体 p VL 1 392 - ut- PA的相应位点中 ,构建了一个含有新的嵌合蛋白基因 ut- PA( 1 )的转移表达载体 p VL1 392 - ut- PA( 1 ) .在昆虫病毒表达系统 sf- 9细胞中表达该嵌合蛋白基因 ,表达上清具有纤溶性 ,用血纤维蛋白平板法和 S2 4 44 显色底物法分别测得活力为 2 4 8IU/ml和 380 IU/ml     

T7 启动子作用下人尿激酶原 cDNA 在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化

化学合成的人尿激酶原ｃＤＮＡ克隆在表达质粒ｐＥＴ－１１ｄ中,在Ｔ７启动子的作用下,经０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得表达。其表达量占菌体总蛋白的１５％,表达产物以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性,Ｚｎ＾２＋选择性沉淀,抗体亲和柱层析,及Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ亲和吸附,所表达的人尿激酶原被纯化为单一条带,其比活约１１００００ＩＵ／ｍｇ。     

Expression of a novel chimeric protein containing the A chain of tissue-type plasminogen activator and the B chain of pro-urokinase in insect cells using the baculovirus system.

A hybrid cDNA tu-pa, which contains Ser1-Thr263 of tissue-type plasminogen activator (t-PA) and Ser138-Leu411 of pro-urokinase (pro-UK) was constructed and expressed in the Sf9-AcNPV system. The expression level was approximate 2.5 mg/L. Tu-PA was purified via one-step affinity column conjugated with monoclonal antibody against the B chain of pro-UK, which showed a single band of approximate 60 kDa in SDS-PAGE. The specific activity of the chimeric protein on fibrin plate was 200,000 IU/mg protein. Tu-PA had a higher selectivity for fibrin than UK and pro-UK. Its activity can be promoted by CNBr degraded fibrin fragments as t-PA.     

Characterization of plasminogen activator produced by an established cell line from human ovary

An established cell line (OC-1) was obtained from human ovarian tissue, which yielded a high concentration of plasminogen activator (PA) in the culture medium. The PA (OC-1-PA) produced by the cell line was purified and compared with urokinase (UK), proform of UK (pro-UK), and tissue-type PA (t-PA) purified from human melanoma cells (Bowes). OC-1-PA was purified by Zn chelate-Sepharose affinity chromatography followed by high-performance liquid chromatography with a Zn chelate-5PW column and with a p-amino-benzamidine-5PW column, giving a yield of 58.3% and a purification factor of 15,439. This purified material revealed a single band of Mr 55,000 on sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis in the presence or absence of reducing agents. Electrophoretic enzymography demonstrated that the Mr 55,000 protein band had a plasminogen-dependent fibrinolytic activity. Treatment with plasmin did not change the Mr even in the presence of reducing agents. These results suggest that OC-1-PA has a single-chain structure protected from protease degradation, which is completely different from UK. The activator had higher affinities for lysine and fibrin than those of UK or pro-UK. An immunological study demonstrated that OC-1-PA cross-reacted with anti-UK IgG but not with anti-t-PA IgG. All these findings indicate that OC-1-PA belongs immunologically to the UK type, but its structure differs from that of UK.     

重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)及其突变体的纯化

稳定高效表达重组人组织型纤溶酶原激活剂 (rht PA)的CHO细胞株和表达组合突变体的细胞株进行了 3L转瓶培养 .将培养上清分别进行了Lys Sepharose 4B亲和层析和Zn2 + Sepharose 4B层析两步纯化 ,rht PA纯度提高了 5 34倍 ,比活达 2 5× 10 5IU mg ,产率为 73% ;突变体纯度提高了1119倍 ,比活达 5 9× 10 5IU mg ,产率为 6 9% .纯化产物SDS PAGE分析显示 ,rht PA和突变体基本都呈单一条带 ,扫描分析均达到 98%以上纯度 .rht PA和突变体在纯化系统中的行为作对照分析发现 ,突变体的构建思想在Lys Sepharose 4B亲和层析过程中有充分体现 .这两步层析组合是很好的纯化t PA及其突变体的方法 ,尤其是Lys Sepharose 4B纯化突变体效果更好     

t—PA昆虫细胞表达及特性分析

With the RT-PCR technique, human tissue-type plasminogen activator (t-PA) cDNA was amplified from human melanoma cells. The sequence was proved to be the same as those reported by foreign researchers. The t-PA cDNA containing whole reading frame was inserted into the transfer vector pBacPAK8. The constructed pBac-tPA and the linear BacPAK6 virus DNA were cotransfected with Tn-5B-1 insect cells by lipofectin-mediated transfection method. Eleven pure recombinant viruses were isolated by plaque assay, and one of them, nominated BactPA3, was selected by PCR identification and biological activity comparison. The t-PA activity expressed in serum-containing media reach the highest level at 72 h postinfection. The activity was 3.04 x 10(3) IU/ml, e.g. 1.8 x 10(4) IU/10(6) cells. The highest expression level in serum-free media was almost the same, but needed more time (at 132 h postinfection). SDS-PAGE fibrin autography showed that the molecular weight of the expressed t-PA was about 68 kDa. Its stimulation by fibrinogen, affinity with fibrin and inactivation in plasma were almost the same as the native t-PA purified from human melanoma cell culture. The half-life of t-PA expressed in serum-free media was seven minutes.