基因组对芸苔属作物原生质体培养及植株再生的影响

本文以包心菜、芜菁油菜、浙油６０１的无菌苗叶肉原生质体为材料,经不同液体培养基浅层培养,细胞分裂并形成愈伤组织。愈伤组织经增殖后,转到分化培养基上诱导分化,均获得了再生植株。本文着重研究了植物基因组对原生质体分裂频率及植株再生的影响。研究结果表明：（１）植物基因组对原生质体分裂频率的影响随原生质体培养基的不同而异;（２）植物基因组对原生质体再生植株影响显著,芜菁油菜的Ａ基因组不利于原生质体再生植株     

微生物原生质体技术

从影响原生质体制备、再生的因素、原生质体融合、原生质体诱为、原生质体再生育种、原生质体转化和原生质体固定化等几个方面,较为全面地介绍了目前原生质体技术的发展现状,对相关机制和技术环节作了简要概述。     

小麦原生质体高效转化体系的建立

植物原生质体广泛应用于植物基因功能研究中,包括瞬时基因表达、亚细胞定位、蛋白互作和蛋白活性分析等。当前,小麦基因的亚细胞定位和功能分析,大多利用模式植物拟南芥等异源的原生质体,易于造成研究结果的不准确。为避免这种情况,小麦原生质体制备及高效转化体系的建立与应用是必需的。在PEG介导的小麦原生质体转化过程中,原生质体分泌的核酸酶大量降解质粒DNA,转化效率的提高因此受到阻碍。为了建立小麦原生质体的高效转化体系,本文测试了抑制胞外核酸酶活性的因素和提高质粒DNA浓度等多个条件对转化效率的影响。结果表明,转化过程中加入双倍用量的质粒DNA进行转化,且始终保持低温环境(1℃)用以抑制核酸酶酶活性,可以使小麦原生质体的转化效率提高至85%。本文还将该系统成功地应用于2个小麦抗病相关蛋白的亚细胞定位研究,证明了该系统的高效性和实用性。该研究对未来相关研究有一定参考价值。     

植物原生质体培养研究进展

自从Ｃｏｃｋｉｎｇ(196 0 )用酶法首次分离出有活性的原生质体 ,1971年Ｔａｋｅｂｅ等首次从烟草叶片分离原生质体 ,经培养获得再生植株 ,原生质体的研究和应用进入了一个新阶段。1　原生质体培养影响因子的研究1 1　培养基种类及成分不同植物原生质体培养的基本培养基不尽相同。培养基种类影响到原生质体的分裂频率、植板率以及小愈伤组织的出现等[1,2 ] 。潘增光[3 ] 等比较了 4种培养基 (ＭＳ、ＭＴ、改良ＭＴ、ＢＨ3)对苹果叶肉原生质体培养的影响 ,结果表明 ,只有在改良ＭＴ培养基中能观察到多细胞团形成 ,而在ＭＳ、ＭＴ、ＢＨ3作为…     

疏绵状嗜热丝孢菌原生质体的制备与再生

以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)为供试菌株,研究了菌龄、酶的种类及浓度、酶解时间、酶解温度和稳渗剂对原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明,制备嗜热丝孢菌原生质体比较适宜的条件为:PDB液体培养基培养28 h,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,0.15 mol/L的溶壁酶,30℃酶解4 h。原生质体再生以0.7 mol/L蔗糖作稳渗剂为最佳。     

银耳原生质体分离与再生条件优化研究*

应用正交设计,研究不同菌株(Tr01、Tr21)、材料(芽孢、菌丝体、子实体)、溶壁酶浓度和酶解温度对原生质体产量的影响。实验结果表明,实验材料对原生质体产量影响最大,以芽孢为材料原生质体产量可达到2.75×107个/ml,而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2.5×106个/ml 和1.0×106个/ml;在35℃下酶解,原生质体产量高;溶壁酶浓度在1%~3%范围内对原生质体产量影响不大;不同菌株原生质体产量差异不显著。本实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影响,结果表明,0.5 mol/L~0.7 mol/L的KCl 对原生质体再生没有显著差异,再生率最高可达32.3%。     

捕食性真菌Duddingtonia flagrans原生质体获得与再生的荧光标记评价

为了更准确快捷地评价利用酶解法酶解捕食性真菌Duddingtonia flagrans菌丝产生的原生质体数量及菌丝细胞壁降解情况,采用活体荧光染料羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE),对该捕食性真菌菌丝酶解后产生的原生质体进行荧光标记,分别考察了标记浓度、标记时间、孵育温度对原生质体标记效果的影响,并观察CFSE标记后的原生质体再生情况。结果表明CFSE终浓度为10μmol/L,标记时间为15min,孵育温度为36℃,是CFSE标记捕食性真菌原生质体的理想条件,该试验同时表明CFSE不影响原生质体的再生率。CFSE作为一种活细胞示踪荧光探针,可以快速高效地标记捕食性真菌原生质体,该方法为捕食性真菌原生质体制备质量的快速评价提供了新的思路。     

小立碗藓PpAux/IAA2基因在原生质体再生过程中的功能分析

以小立碗藓(Physcomitrella patens(Hedw.)Mitt.)野生型及抗生长素的突变体Ppiaa2-87为实验材料,分析了生长素早期应答基因PpAux/IAA2在原生质体再生过程中的调控机制。分别采用qRT-PCR、FDA染色、DNA倍性分析、DAPI染色、甲基化敏感扩增多态性分析等方法,对原生质体再生过程的相关基因表达、存活率、细胞周期进程、染色体重塑及DNA甲基化进行了分析。结果显示:PpAux/IAA的3个同源基因在野生型0 h原生质体中的表达量较原丝体、48 h和96 h原生质体均明显升高;随着培养时间的延长,Ppiaa2-87原生质体的存活率明显下降;原生质体进入S期受到抑制;部分0 h原生质体的染色质未发生重塑,且染色质重塑复合体SWI/SNF蛋白家族4个基因的表达水平在0 h原生质体中较原丝体下降;Ppiaa2-87的0 h原生质体甲基化程度偏高。研究结果说明,PpAux/IAA2调控的生长素信号通路在小立碗藓原生质体再生过程中具有重要作用,该基因的突变影响了原生质体DNA甲基化及染色质重塑等细胞重新编程过程,导致原生质体不能获得多能性而死亡。     

菊科植物原生质体研究进展

介绍了目前菊科植物原生质体研究进展,重点对菊科植物原生质体分离、培养、影响原生质体再生的因素、原生质体再生植株的变异、原生质体的应用等方面的研究工作进行了总结,提出了存在的问题和今后的工作重点。     

谷氨酸生产菌原生质体形成及再生最佳条件的研究

本文通过不同前处理、不同高渗缓冲液、不同酶量、温度及酶解时间对原生质体形成和再生的影响试验,确定了最佳酶解工艺条件,并采用简便的蔗糖美兰染色液进行原生质体释放及形态学的观察。     

产琥珀酸放线杆菌的原生质体制备与再生

基因组重组技术是一项重要的菌种改造技术,原生质体制备和再生是进行基因组重组的前提和基础。目前少有关于产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC2650原生质体研究的报道。为了优化该菌的原生质体制备和再生条件,及利用基因组重组技术构建优良菌种提供参考,研究了甘氨酸预处理,菌龄,酶浓度,作用时间,温度对产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的影响,并考察了不同渗透压稳定剂对其再生的影响。结果表明,菌体在添加了0.6mg/ml甘氨酸的TSB培养基中培养5h后收集,用SMM稀释到OD660=1.0,用0.025mg/ml溶菌酶在37℃下酶解45min制备原生质体,将原生质体涂布于含0.3mol/L蔗糖的再生培养基中,再生率最大,达到40.9%。确定了产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的最佳条件,所用的原生质体制备的方法对琥珀酸的产生没有影响,这为进一步开展该菌的原生质体诱变及基因组重组等研究奠定了基础。     

麦角菌和雀稗麦角菌原生质体的形成与再生

本文报道了快速制备麦角菌(Claviceps purpurea)和雀稗麦角菌(Claviceps paspali)原生质体的方法及影响原生质体形成的若干因素。用适当方法培养菌丝体,利用商品溶壁酶制剂(10mg/ml),以0.7mol/l KCl为原生质体高渗液,28℃为酶解温度,处理时间仅需1—2h,菌丝体细胞壁即被彻底消化而释放出大量原生质体。在适当的固体再生培养基上,两种麦角菌原生质体的再生频率分别为7.7%和13.2%左右。培养基中添加25mg/l脱氧胆酸钠有利于形成易于计数和分离的小菌落。本文还就CaCl_2,MgCl_2及低温保藏(3—4℃,30天)对于原生质体稳定性与再生的影响作了初步探讨,并证实溶壁酶对原生质体有明显的破坏作用。     

食用菌原生质体分离与再生的技术

用2%的溶壁酶处理平菇及香菇菌丝体,原生质体释放量达10~7个/ml以上。不同渗透压、稳定液、再生培养基、培养条件对食用菌原生质体分离和再生有不同的影响。本研究探索出一个原生质体分离与再生的较优系统。原生质体融合的研究在创造食用菌远缘杂交、解决珍贵野生类型驯化栽培,了解分类学上亲缘关系以及研究导核体遗传等具有重要意义。     

谷子胚性愈伤组织粘液提取物对原生质体培养的影响

将谷子胚性愈伤组织粘液提取物添加到谷子原生质体培养基中,其对原生质体培养的影响表明该提取物有助于原生质体形成细胞壁;并且该类有粘液分泌的念伤组织的原生质体游离所需的酶液浓度低、处理时间短。由原生质体形成完整细胞的数量在一定范围内与谷子原生质体培养的植板率相对应;通过增加形成完整细胞的数量可较大幅度地提高原生质体培养的植板率。     

新疆杨叶肉原生质体游离和纯化的研究

以新疆杨(Populus albaL.var.pyramidalis)无菌苗叶片为材料,就其原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了研究。结果表明,cellulase R-10、hemicellulase和pectolase Y-23对原生质体产量有极显著影响。适宜新疆杨叶片原生质体游离的条件为CPW KM8P 3.0?llulase R-10 0.5%~1.5%macerozyme R-10 0.5%hemicellulase 0.1%~0.5%pectolase Y-23 0.6 mol/L甘露醇,酶解温度27℃,酶解时间8 h。在此条件下,原生质体产量达1.57×107个/gFW,活力79.41%,而且蔗糖等密度离心法中的上浮法纯化原生质体效果最佳,最适蔗糖浓度为30%。     

黑曲霉原生质体形成与纯化的研究

研究了黑曲霉菌丝原生质体形成的条件,讨论了培菌方式,菌龄,酶系统,酶解温度,酶解时间及渗透压稳定剂对原生质体形成的影响,结果表明,采用１．５％纤维素酶,以ＮａＣｌ为渗透压稳定剂酶解菌丝体,可获得大量原生质体,并对原生质体纯化的两种方式作了比较,同时对原生质体的释放进行了观察。     

不同因素对金针菇原生质体制备和再生的影响

比较了不同浓度裂解酶及组合、渗透压稳定剂、酶解时间等因素对金针菇原生质体得率的影响以及不同渗透压稳定剂、培养基、接种方法等因素对金针菇原生质体再生的影响。试验结果表明:固体培养10d的金针菇菌丝,以0.5mol/L KCl作渗透压稳定剂,加入1%纤维素酶和1%溶菌酶在25℃下酶解1.5h,分离原生质体效果最佳,原生质体产量可达27.8×105个/ml以上;以0.5mol/L KCl作渗透压稳定剂,在25℃条件下,金针菇原生质体采用直接涂布法接种在RCM培养基上培养,再生率最高为0.5%。     

贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的研究

目的:研究不同方法对贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的影响,筛选适合用于贡蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方案.方法:用不同的酶浓 度、酶组合及不同的酶解时间对贡蕉胚性悬浮细胞进行原生质体分离,并对不同继代时间的胚性悬浮细胞的原生质体产量和活力进行研究.结果:贡蕉胚性悬浮细胞 在酶组合为3.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10和0.15%果胶酶Y-23的酶溶液中,酶解8h可获 得高产量的原生质体,采用继代7d的贡蕉胚性悬浮细胞进行原生质体分离时获得的原生质体产量最高,达到1.2×107个/mL PCV ECS,原生质体活力达到85%以上.结论: 合适的酶组合、酶浓度和酶解时间有利于贡蕉胚性悬浮细胞的原生质体分离,继代7d 后的贡蕉胚性悬浮细胞最适合用于原生质体分离.     

蕨麻愈伤组织原生质体制备条件的优化

以青海‘蕨麻4号’诱导培养的愈伤组织为材料,采用4因素3水平L9(34)正交实验,研究酶类组合、酶解时间、甘露醇浓度及离心速度等主要因素对蕨麻原生质体分离的影响,建立高效、稳定的蕨麻原生质体分离体系,为进一步通过原生质体融合、基因工程等方法对蕨麻进行品种改良奠定基础。结果表明:各因素对蕨麻原生质体产量的影响顺序为:酶类组合酶解时间甘露醇浓度离心速度;青海‘蕨麻4号’愈伤组织原生质体的最适酶解条件为:2.0%纤维素酶+0.75%果胶酶,40r/min振荡酶解10h,甘露醇浓度为0.5mol/L,离心转速为1 000r/min时原生质体的产量达最大(8.96×10~5 cells/g),活力为92.77%。     

金针菇原生质体分离制备、融合、再生及融合子检出

探讨了利用金针菇菌丝体分离、制备原生质体;不同的酶浓度和酶解时间对原生质体得率的影响;以及八种再生培养基的选择性试验.建立了金针菇原生质体的分离、制备、融合及再生的试验体系.试验共获得209株再生菌株,通过核染色检测,共获得37株具有双核和锁状联合的再生株.