马尾松毛虫质多角体病毒NS5蛋白的表达和功能初步分析

马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a(+)载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白.利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRNA结合.     

马尾松毛虫质型多角体病毒NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化,获得一株单一类型的质型多角体病毒.提纯的病毒粒子经SDS-热酚法抽提,在使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA,回收纯化第九片段S9.SgRNA双链经高温变性,使用正反两种引物逆转录合成cDNA双链,使用同样的引物经PCR扩增后,克隆在pMD18-T载体上.利用两种引物组合,获得了大小两个亚克隆片段.序列测定结果表明,较小亚克隆片段长405bp,较大亚克隆片段长677bp,经过序列拼接,得到一个977bp的序列,其中包含一个963bp大的开放阅读框(ORF).推测DpCPVS9基因编码一个320个氨基酸的多肽,分子质量35.66kDa.和家蚕1型质型多角体病毒的I株(BmCPV-II strain)位于第九片段的NS5蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为86.0%和93.4%.     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS－酚抽提,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNDA,回收纯化第十片段S10。S10经DMSO变性,逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增后,克隆在pGEM-T载体上,对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定。结果表明,克隆片段全长763bp,起始密码AUG位于3－5残基,终止密码UGA位于747－749残基。推测DpCPV多角体蛋白基因编码248个氨基酸的多肽,分子量28kD。和家蚕质型多角体病毒（BmCPV）多角体蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为89.3%和97.6%。     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBACHTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBACS10,重组穿梭质粒BacmidS10,重组杆状病毒AcS10。多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测。结果表明:S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核。     

马尾松毛虫质型多角体病毒NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖,纯化,获得一株单一质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS－热酚法抽提,在使用低熔点琼脂凝胶电泳分离基因组dsRNA,回收纯化第九片段S9。SgRNA双链经高温变性,使用正反两种引物逆转录合成cDNA双链,使用同样的引物经PCR扩增后,克隆在pMD18-T载体上。利用两种引物组合,获得了大小两个亚克隆片段。序列测定结果表明,较小亚克隆片段长405bp,较大亚克隆片段长677bp,经过序列拼接,得到一个977bp的序列,其中包含一个963bp大的开放阅读框（ORF）。推测DpCPVS9基因编码一个320个氨基酸的多肽,分子质量35.66kDa。和家蚕1型质型多角体病毒的I株（BmCPV-I Istrain)位于第九片段的NS5蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为86．0％和93．4％。     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBAC HTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBAC S10,重组穿梭质粒Bacmid S10,重组杆状病毒Ac S10.多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测.结果表明S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核.     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化,获得一株单一类型的质型多角体病毒.提纯的病毒粒子经SDS-酚抽提,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNDA,回收纯化第十片段S10.S10经DMSO变性,逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增后,克隆在pGEM-T载体上.对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定,结果表明,克隆片段全长763bp,起始密码AUG位于3～5残基,终止密码UGA位于747～749残基.推测DpGPV多角体蛋白基因编码248个氨基酸的多肽,分子量28kD.和家蚕质型多角体病毒(BmCPV)多角体蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为89.3%和97.6%.     

家蚕对马尾松毛虫质型多角体病毒的敏感性

用虫体克隆技术,对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株（DpCPV-HN）进行了分离纯化,鉴定为质型多角体病毒1型。以家蚕春蕾×镇珠杂种F₁代及自交的F₂代4或5日龄幼虫进行毒力测定,以纯化的家蚕质型多角体病毒对F₁代幼虫的毒力测定为对照。结果表明：家蚕品种春蕾×镇珠对家蚕质型多角体病毒敏感,马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株能引起其感染发病;马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染家蚕品种春蕾×镇珠F₁代幼虫和F₂代幼虫28天后的半致死剂量（LD₅₀）分别为885个和18个CPB(质多角体),前者为后者的49倍。马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染后的家蚕,其结茧率、化蛹率、羽化率、全茧量、茧层量和单蛾产卵数均有所下降,全茧量、茧层量、茧层率和单蛾产卵数与病毒感染剂量之间无显著关联。     

马尾松毛虫CPV基因组S7的序列分析及部分序列的原核表达

马尾松毛虫质多角体病毒(湖南株)基因组S7节段(AY180908)cDNA克隆及序列分析结果表明S7由1501个碱基组成,编码由448个氨基酸组成的分子量为49.8 kDa的多肽P50.5′末端和3′末端具有5′-AGTAA-3′和5′-GTTAGCC-3′末端保守序列.该基因组与舞毒蛾质多角体病毒1型和家蚕质多角体病毒1型S7节段有很高的同源性,核苷酸序列同源性分别为97.2%和87.0%,氨基酸序列同源性分别为98.7%和92.8%.P50多肽与人型支原体的 DnaK样蛋白在C-末端有相似性.本文报道了编码P50 C259的cDNA序列的克隆并作了原核表达,当用1.0 mmol/L IPTG 诱导2h,分子量约为37.3 kDa的融合蛋白在大肠杆菌BL21中得到大量表达.     

单引物法扩增马尾松毛虫CPV基因组第8片段及其序列分析

本文利用T4 RNA连接酶将5'-磷酸、3'-氨基修饰的引物1连接到马尾松毛虫质型多角体病毒第8片段dsRNA的3'-OH端.经逆转录、退火、补齐形成全长双链cDNA.使用单一的互补引物2进行PCR扩增.扩增产物克隆在pMD18-T载体上.对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定,结果表明,克隆片段全长330bp,S'端具有CPV-1型末端保守序列AGTAAA'端具有保守序列GTTAGCC.起始密码子从ATG位于38-40残基,终止密码子TAA位于1208～1210残基.推测S8片段编码390个氨基酸多肽,分子量为44kDa.与舞毒蛾质型多角体病(LdCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为97%和98%.与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸的同源性分别为83%和85%.与人的呼肠孤病毒第8片段比较没有明显的同源性.     

文山松毛虫质型多角体病毒（DpwCPV）NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus Wenshanensis cytoplasmic polyhedrosis virus, DpwCPV)的增殖、纯化,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS热酚法抽提得到基因组dSRNA,使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化第九片段S9。S9 RNA双链经高温变性,逆转录合成cDNA双链。根据DpwCPV与BmCPV1的同源性设计引物,将S9进行PCR扩增后,克隆到PMD18T载体上。最终获得一个977bp的序列,其中包含一个963bp的开放阅读框(ORF)。推测DpwCPV S9基因编码一个320个氨基酸的蛋白,分子量约为35560。     

单引物法扩增马尾松毛虫CPV基因组第8片段及其序列分析

本文利用T4 RNA连接酶将5'－磷酸,3'-氨基修饰的引物1连接到马尾松毛虫质型多角体病毒第8片段dsRNA的3'-OH端,经逆转录,退火,补齐形成全长双链cDNA。使用单一的互补引物2进行PCR 增,扩增产物克隆在pMD18-T载体上,对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定。结果表明,克隆片段全长330bp,S'端具有CPV－1型末端保守序列AGTAAA'端具有保守序列GTTAGCC。起始密码子从ATG位于38－40残基,终止密码子TAA位于1208－1210残基。推测S8片段编码390年氨基酸多肽,分子量为44kDa。与舞毒蛾质多角体病（LdCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为97％和98％。与家蚕质型多角体病毒（BmCPV）第8片段相比较,核苷酸和氨基酸的同源性分别为83％和85％。与人的呼肠孤病毒第8片段比较没有明显的同源性。     

马尾松毛虫质型多角体病毒S4的cDNA克隆及序列分析

从马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株中提取病毒核酸,回收、纯化第四片段S4,经RT-PCR扩增得到了S4的cDNA克隆并测定了其全序列。结果表明,S4全长由3262个碱基组成,包含一个编码1058个氨基酸的完整开放阅读框架。B1ast同源分析显示,DpCPV S4与LdCPVS4、BmCPVS4和RRSV S2编码蛋白氨基酸的同源性分别为94％、92％和22％。另外,氨基酸序列部分区域与Methanosarcina mazei Goel的甲基化转移酶有同源性,且序列中含有鸟苷酸转移酶活性位点。     

影响DpCPV杀虫剂高产条件的研究

DpCPV杀虫剂的产量不仅受到气候、环境等因素的影响,而且严重受到生产工艺技术水平的制约。针对DpCPV杀虫剂生产过程中工艺技术问题,我们对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株在室内、室外和林间大量增殖中的集虫虫质、接种浓度、频率、收获时间等及其相互间的关系进行了详细研究,得出在DpCPV杀虫剂生产过程中接种1×10~7CPB/mL病毒浓度为宜,接种虫龄以4～5龄虫为宜,收获病毒时间13～14d为宜。其室外单虫病毒产量平均可达到7.5×10~8CPB,比国内报道要高。研究结果对DpCPV杀虫剂的高产增殖有很强的指导意义。     

文山松毛虫质型多角体病毒S8片段cDNA克隆与原核表达

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)S8片段被克隆和测序,该片段全长1332bp,编码390个氨基酸组成的分子量大约为43kDa的蛋白P44。根据本实验室测定出的马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)基因组全序列,设计引物,扩增出文山松毛虫质型多角体病毒s8部分片段,并亚克隆出p44基因序列,然后将p44基因序列cDNA克隆到表达载体pET-28a中,构建成表达质粒pET-S8,用IPTG诱导大肠杆菌BL21,经SDS-PAGE证明p44基因在大肠杆菌中获得成功表达,并对其编码蛋白序列进行了分析。     

文山松毛虫质型多角体病毒S8片段cDNA克隆与原核表达

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)S8片段被克隆和测序,该片段全长1332bp,编码390个氨基酸组成的分子量大约为43kDa的蛋白P44.根据本实验室测定出的马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)基因组全序列,设计引物,扩增出文山松毛虫质型多角体病毒S8部分片段,并亚克隆出p44基因序列,然后将p44基因序列cDNA克隆到表达载体pET-28a中,构建成表达质粒pET-S8,用IPTG诱导大肠杆菌BL21,经SDS-PAGE证明p44基因在大肠杆菌中获得成功表达,并对其编码蛋白序列进行了分析.