结核杆菌活动期高表达基因Rv1776c的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的 构建表达结核分枝杆菌Rv1776c基因的重组耻垢分支杆菌,并鉴定该基因在重组耻垢分支杆菌中的活性。方法 采用PCR技术克隆结核分枝杆菌Rv1776c基因,构建大肠埃希菌‒分支杆菌穿梭表达质粒pMV-Rv1776c,通过酶切和测序鉴定其正确性,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分支杆菌mc2155中。以SDS-PAGE及Western blot检测证实Rv1776c蛋白在重组耻垢分支杆菌内的表达。结果 重组耻垢分支杆菌构建成功,生长曲线说明重组质粒不会影响耻垢分支杆菌的体外生长;SDS-PAGE及Western blot检测证实Rv1776c在耻垢分枝杆菌内表达出相对分子量约56 kD的Rv1776c蛋白。结论 成功构建了Rv1776c基因的穿梭质粒pMV-Rv1776c,且该质粒在耻垢分枝杆菌内具有生物活性,为进一步研究其表达产物的功能提供基础。     

小毛莨内酯对重组耻垢分枝杆菌eis基因表达的影响

目的 研究小毛莨内酯(Ternatolide,Tern)对重组耻垢分枝杆菌生长增殖及其eis基因表达的影响.方法 将5×105 MS-eis-PMV261接种于LB培养基培养并加入200 mg/L的Tern作为实验组,MS-eis-PMV261单独培养作为对照,不同时间点测量取菌液波长为600 nm的A值,根据所测A值绘制增殖曲线;提取菌液DNA以RT-PCR方法检测Tern对eis基因表达的影响;免疫印迹法SDS-PAGE及Western Blot检测Tern对EIS蛋白表达的影响.结果 Tern对两组重组耻垢分枝杆菌增殖差异无统计学意义(P ＞0.05);Tern可抑制eis基因的表达(P＜0.05);SDS-PAGE及Western Blot检测发现Tern可显著降低EIS蛋白的表达(P＜0.05).结论 Tern对重组耻垢分枝杆菌的增殖无影响,但可抑制结核分枝杆菌eis基因及其表达的蛋白.该结果对研究持留性结核分枝杆菌的药物治疗提供了实验依据.     

比较口服不同亲和力重组耻垢分支杆菌调节免疫的差异

目的:Th1与Th2的平衡紊乱是过敏性哮喘的免疫学基础,本研究通过给予小鼠口服免疫不同亲和力屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌,来比较其调节免疫应答的差异.方法:1,分别给予6-8周BALB/c小鼠口服接种Mycobacterium Smegmatis(M.S)、pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S,在末次免疫后第14、28、56天分别用夹心ELISA法测定小鼠血清及脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2及IL-4的含量.结果:夹心ELISA结果显示,无论是血清还是脾脏淋巴细胞培养上清中,各组IFN-γ、IL-2水平逐渐升高,IL-4水平逐渐降低,8周时更明显,pCW-Der p2-PEB1-rM.S组与M.S、pCW-Der p2-rM.S组相比有明显统计学差异.体外给予Der p2蛋白刺激后,pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S组变化更加明显,而M.S组无明显变化.结论:小鼠口服免疫pCW-Der p2-PEB1-rM.S能明显提高Th1型免疫反应,与pCW-Der p2-rM.S组相比有统计学学差异.三种不同亲和力重组耻垢分枝杆菌经口服后均能诱导小鼠产生Th1型免疫应答,且pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S诱导产生的Th1优势应答具有Der p2抗原特异性.本研究弥补了粘膜型疫苗低亲和力的不足,为新型口服疫苗的制备和改进创造了条件.     

流式细胞术检测胞内重组耻垢分枝杆菌的活力研究

目的建立一种快速检测胞内分枝杆菌活力的方法。方法将一定量培养至对数生长期的含pMV-eis的重组耻垢分枝杆菌感染U937巨噬细胞,以含空质粒的耻垢分枝杆菌为对照,吞噬作用2 h后洗去胞外细菌,再分别培养4、12、24和48 h后收集细胞并裂解之。获得的胞内细菌用FDA荧光染料染色后用流式细胞仪检测死亡率,并与平板菌落计数法进行比较。结果流式细胞仪检测出感染12 h后重组耻垢分枝杆菌胞内死亡率较对照组均有显著下降（P〈0.05）,流式细胞仪检测法与平板菌落计数法相比差异无统计学意义（P〉0.05）。结论流式细胞术与传统的平板计数法相比具有快速、敏感、方便的特点,可用于分枝杆菌活菌快速检测。     

结核分枝杆菌Rv1759c结构域与IL-2融合蛋白的表达与鉴定

目的：构建结核分枝杆菌（MTB）Rv1759c结构域（Rv1759cD domain,Rv1759cD）与人IL-2（hIL-2）融合基因,并在大肠杆菌中表达获得重组的融合蛋白Rv1759cD-IL-2。方法：用PCR方法从MTB H37Rv基因组扩增Rv1759cD基因片段,测序后与hIL-2基因构建融合基因,并克隆到表达载体pProEX HTa。融合基因在大肠杆菌DH5α中诱导表达,经SDS-PAGE分析后,分别与His mAb、IL-2mAb和结核病人血清进行Western-blot鉴定,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果：获得的Rv1759cD基因经测序与GenBank公布的序列完全一致,与hIL-2基因连接后,构建的融合基因在大肠杆菌中有效表达。表达蛋白相对分子量为30KDAa,与预测值相符;Western-blot结果显示,在相对分子量30KDAa处分别与His mAb和鼠抗IL-2 mAb形成结合带,并与结核病人血清出现特异性结合。通过Ni-NTA亲和层析,可得到纯化的目的蛋白。结论：成功表达、纯化和鉴定了Rv1759cD-IL-2融合蛋白,并有可能作为新型结核病疫苗的靶抗原。     

结核分枝杆菌Rv1759c 结构域与IL-2 融合蛋白的表达与鉴定

目的:构建结核分枝杆菌(MTB)Rv1759c结构域(Rv1759cD domain,Rv1759cD)与人IL-2(hIL-2)融合基因,并在大肠杆菌中表达获得重组的融合蛋白Rv1759cD-IL-2。方法:用PCR方法从MTB H37Rv基因组扩增Rv1759cD基因片段,测序后与hIL-2基因构建融合基因,并克隆到表达载体pProEX HTa。融合基因在大肠杆菌DH5α中诱导表达,经SDS-PAGE分析后,分别与His mAb、IL-2mAb和结核病人血清进行Western-blot鉴定,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:获得的Rv1759cD基因经测序与GenBank公布的序列完全一致,与hIL-2基因连接后,构建的融合基因在大肠杆菌中有效表达。表达蛋白相对分子量为30KDAa,与预测值相符;Western-blot结果显示,在相对分子量30KDAa处分别与His mAb和鼠抗IL-2 mAb形成结合带,并与结核病人血清出现特异性结合。通过Ni-NTA亲和层析,可得到纯化的目的蛋白。结论:成功表达、纯化和鉴定了Rv1759cD-IL-2融合蛋白,并有可能作为新型结核病疫苗的靶抗原。     

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建

目的 建立可表达绿色荧光蛋白的耻垢分枝杆菌,便于对耻垢分枝杆菌进行直观检测和快速定量。方法利用PCR技术从真核表达质粒pLVTH扩增获得绿色荧光蛋白的编码基因,克隆人大肠埃希菌一分枝杆菌穿梭载体pMV261,建立重组质粒pMVGFP,并经酶切鉴定证实。利用电穿孔技术将pMVGFP转化入耻垢分枝杆菌,利用卡那霉素抗性筛选重组耻垢分枝杆菌克隆,扩大培养后直接涂片,荧光显微镜镜检。结果重组质粒pMVGFP构建正确;将重组耻垢分枝杆菌在荧光显微镜下观察,证实绿色荧光蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。结论自发释放荧光的重组耻垢分枝杆菌的成功建立,为研究结核病致病机制和快速筛选化学药物等奠定了基础。     

选择性σ因子SigF影响耻垢分枝杆菌的抗氧化能力

[目的]σ因子是细菌RNA聚合酶全酶的重要组分,包括必须σ因子和选择性σ因子.SigF作为重要的选择性σ因子影响结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的致病性和毒力等重要的功能.与之对应的在非致病性、快速生长的分枝杆菌耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)中,sigF的调控可能与其适应一定的生理环境相关.[方法]通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析,系统的研究了耻垢分枝杆菌SigF的应答调控.[结果]sigF敲除菌株与野生菌相比,对过氧化氢特别敏感,并且这种敏感性能够通过反式互补野生型的基因得到回复 ;由于细菌体内的抗氧化能力与耐药性有较高的相关性,进一步分析sigF敲除菌株的抗药性和抗氧化相关基因的表达情况,显示SigF影响细菌清除过氧化氢的能力,但是并不影响包括异烟肼等药物的敏感性及与异烟肼敏感性相关基因的表达.[结论]SigF调控的活性氧胁迫应答途径与异烟肼活化的氧化胁迫应答途径不同.另外,实验显示SigF参与了耻垢分枝杆菌的色素的合成,提示SigF参与的是光氧化胁迫应答途径,与药物引起的氧化胁迫应答途径是不同的通路.     

结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的亚细胞定位

【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和EGFP序列,一并插入真核表达载体构建出pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP。将构建好的质粒瞬时转染L929细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光、流式细胞分选以及Western blotting检测融合蛋白的表达以及亚细胞定位。【结果】成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP,瞬时转染L929细胞后融合蛋白tRv3194c定位于线粒体膜上,且重组痘苗病毒vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。【结论】Rv3194蛋白的PDZ结构域与线粒体外膜相关蛋白结合,为了解该蛋白在细胞内的致病机制提供重要线索。     

结核杆菌eis基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建结核分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物活性。方法:采用PCR技术克隆结核分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV-eis,经酶切和测序鉴定其正确性,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc²155中,采用SDS-PAGE和Western blot检测eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达。结果:成功构建结核杆菌eis基因穿梭表达载体pMV-eis;生长曲线说明重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE 和Western blot检测证实eis在耻垢分枝杆菌中可表达出相对分子量约42kDa的Eis蛋白。结论:成功构建了eis基因穿梭表达质粒pMV-eis,且该重组质粒在耻垢分枝杆菌中具有生物活性,为下一步研究表达产物Eis的功能奠定了一定基础。     

结核分枝杆菌蛋白Rv3425对细菌表型及毒力影响的研究

为探索蛋白Rv3425在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M. tuberculosis)中的功能,本研究以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M. smegmatis)为模式菌株,构建重组了耻垢分枝杆菌Ms-Rv3425。分别将构建菌株(Ms-Rv3425)、野生株(Ms)及空载对照(Ms-Pact)接种于7H9-OADC培养基中37 ℃培养,观察Ms-Rv3425与Ms及Ms-Pact之间在生长速率、菌落形态、生物膜以及聚集度方面的差异。分别用低pH值以及含有十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、氨苄西林、异烟肼及利福平的培养基进行培养,计算存活率以分析抗逆和抗药能力;用上述压力条件培养结核分枝杆菌标准株H37Ra,分析Rv3425内源表达量的变化;进行THP-1细胞感染和BALB/c小鼠攻毒实验分析菌株的毒性变化。结果显示,与Ms及Ms-Pact相比,Ms-Rv3425的菌落形态更为粗糙且隆起,成膜及聚集能力增强;在压力条件下,Ms-Rv3425表现出更高的抗逆和抗药能力,H37Ra中Rv3425的表达量也显著上调;胞内存活率及小鼠致死率更高,各脏器病理损伤更为严重。综上所述,过表达Rv3425能够改变耻垢分枝杆菌的表型,提高抗逆性、抗药性和毒力。深入探讨PPE家族蛋白Rv3425的功能,将为结核病的防治带来新的视角。     

Mycobacterium smegmatis displays the Mycobacterium tuberculosis virulence-related neutral red character when expressing the Rv0577 gene

Neutral red staining is a cytochemical reaction that has been found to be related to Mycobacterium tuberculosis virulence and, therefore, the component involved in it is thought to be a virulence factor. To study the molecular basis of this reaction we constructed an M. tuberculosis cosmid library in Mycobacterium smegmatis and selected recombinant neutral red positive clones. Heterologous complementation identified Rv0577 as the gene responsible for this trait and we have also shown that it is expressed as a single polycistronic unit together with Rv0576 which could also be involved in the neutral red staining.     

结核分枝杆菌Rv1884c基因的克隆及其原核表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv1884c基因的表达蛋白。方法:制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX-4T-1构建质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH5α,再经IPTG诱导表达GST-1884融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式。结果:扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,转化大肠杆菌DH5α后经诱导产生了高水平的表达产物。结论:构建了pGEX-4T-1-Rv1884c质粒载体,并诱导表达了GST-1884融合蛋白,为进一步研究Rv1884c蛋白的活性及其功能,探讨结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1168c蛋白的基因表达、纯化及结构分析

【目的】应用原核表达体系对结核分枝杆菌PPE蛋白家族Rv1168c进行高效表达,进一步进行蛋白纯化和结构分析。【方法】以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增Rv1168c基因,构建pET32a-Rv1168c重组质粒;转化重组质粒到大肠杆菌DH5α并在BL21(DE3)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)鉴定Rv1168c在大肠杆菌中的表达情况;Ni-NTAHis﹡Bind Resin纯化重组蛋白Rv1168c;SDS-PAGE和质谱分析测定相对分子量后,用圆二色光谱(CD)和同源模建方法分析和检测重组蛋白Rv1168c的二级和三级结构。【结果】成功克隆了971bp的目的基因Rv1168c,并获得了高纯度的重组蛋白Rv1168c。重组蛋白的分子量为51.5kDa(含载体蛋白)。25℃时重组蛋白Rv1168c的二级结构包括34.4%α螺旋,33.7%β转角,31.9%无规则卷曲,它的三维模型显示为(β/α)5结构。【结论】成功得到高纯度的重组目的Rv1168c蛋白,并初步进行了结构分析,为进一步对Rv1168c结构和功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌脂蛋白Rv1016c增强细菌成膜能力和抑制自噬

目的研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)脂蛋白Rv1016c在Mtb感染和结核病发病中的作用和机制。方法将Mtb脂蛋白Rv1016c基因导入野生耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, MS)构建重组菌株MS-Rv1016c,比较脂蛋白Rv1016c对菌体生长、成膜能力、细菌聚集、毒力等方面的影响,评估重组菌株MS-Rv1016c对自噬的影响。结果 Rv1016c基因的导入,因过表达脂蛋白使得MS的菌落变大、褶皱增加,使菌体聚集度降低,使细菌成膜速度加快、生物被膜产量增加;Rv1016c显著抑制巨噬细胞自噬,促进细菌在细胞内持留。结论 Rv1016c能够促进MS生物被膜形成,抑制细胞自噬,增强细菌毒力。为研究脂蛋白在Mtb致病机理中的作用提供理论依据。