幽门螺杆菌感染与胃黏膜上皮细胞DNA甲基化的研究进展

在癌症发生表观遗传学研究中,DNA甲基化是研究最多也最深入的一种机制,异常甲基化可导致胃黏膜上皮细胞癌变.幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hpylori)是胃癌的第Ⅰ类致癌原,在“慢性浅表性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠上皮化生-不典型增生-胃癌”的癌变模式中可能起先导作用.胃癌相关基因的异常甲基化和H.pylori的致癌机制均是目前研究的热点,本研究综述H.pylori感染与胃黏膜上皮细胞DNA异常甲基化的关系,阐述H.pylori感染介导慢性炎症诱发胃黏膜上皮细胞DNA甲基化的机制.     

大肠杆菌N~α-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原N末端乙酰化修饰的影响

目的:研究大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原(ProTα)N末端乙酰化修饰的影响。方法:在大肠杆菌中共表达ProTα与大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI,同时设置只表达ProTα的对照菌,分别提取纯化ProTα,利用HPLC检测其发生乙酰化修饰的程度。结果:ProTα的乙酰化修饰发生在翻译后水平,有无RimI的过表达、诱导时间的长短以及这两个因素之间的交叉效应均对ProTα的乙酰化程度有影响,其F值分别为53.8、89.22及16.28,P值均小于0.0001;无论有无RimI过表达,乙酰化的ProTα所占比例在诱导6 h后逐渐升高(P<0.0001);在过表达Ri-mI的菌株中,乙酰化的ProTα在诱导12 h后占37.4%,而在无RimI过表达的菌株中占64.3%;RimI对ProTα乙酰化的抑制作用从诱导6 h后开始显现(P=0.0007)。结论:在大肠杆菌中,过量的Nα-乙酰基转移酶RimI可抑制人胸腺素α原的乙酰化修饰。     

高致病性2型猪链球菌毒素-抗毒素系统SezAT的鉴定与活性研究

【目的】对我国高致病性2型猪链球菌05Z33基因组的89K毒力岛序列进行生物信息学分析,发现存在一对与化脓链球菌Epsilon-zeta(ε-ζ)同源的Ⅱ型毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA)——SezAT,推测该系统具有稳定89K毒力岛使其不易丢失的作用。验证SezAT为有活性的TA系统。【方法】对SezAT进行了生物信息学分析;RT-PCR验证SezAT共转录特性;在大肠杆菌中选择性地诱导表达毒素蛋白SezT和抗毒素蛋白SezA;最后通过同源重组技术敲除SezAT系统。【结果】sezAT由同一操纵子控制,SezT可抑制细菌生长,SezA可中和SezT的毒性作用,同源重组成功获得sezT敲除突变株。【结论】证实SezAT为一对有活性的毒素-抗毒素(TA)系统,为进一步研究SezAT可能发挥稳定89K毒力岛的功能,同时获得89K毒力岛缺失突变株并深入认识89K在我国高致病性SS2中的作用奠定了基础。     

细菌中Ⅰ型毒素-抗毒素系统的研究进展

毒素-抗毒素系统是广泛存在于细菌和真菌细胞内的一对小型遗传控制元件,毒素基因编码稳定的蛋白质分子,抗毒素基因编码的则是稳定性较差的蛋白质或者是具有调控功能的RNA.人们对于毒素分子在细胞内的生物靶标、分子结构与功能、体内调节机制等进行了大量的研究,不仅揭示了毒素-抗毒素的生理功能,而且为多种生物技术中的应用提供了新的素材.目前发现共有5大类型的毒素-抗毒素系统,其中Ⅰ型毒素-抗毒素系统的抗毒素分子为调节型RNA,可以通过多种不同途径与毒素蛋白质的mRNAs结合从而中和毒素的细胞毒性.Ⅰ型毒素-抗毒素系统以其独特的调节性RNA的调控方式,成为目前毒素-抗毒素研究中的重要热点.本文将对目前Ⅰ型毒素-抗毒素系统的研究进展进行综述,并对其可能的应用前景进行展望.     

禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2(血清型O2:K89)Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株A2△fimH::Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20(温度敏感性)以去除上述缺失突变株中抗性基因标志,结合PCR扩增和测序结果,证明fimH基因缺失株.A2△fimH的正确构建.通过fimH基因互补试验使A2△fimH缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性.红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,野生株呈现良好的凝集效果,并能被0.5%甘露糖完全抑制,而A2△fimH缺失突变株未呈现任何凝集现象.体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下,A2△fimH缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株.禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株成功构建,为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制,肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础.     

不吸水链霉菌梧州新亚种限制-修饰系统初探

采用菌丝体原位包埋方法和高压脉冲电泳技术从不吸水链霉菌梧州新亚种(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis neosubsp. 11371)中分离得到两条质粒DNA带.通过双向电泳证明,2个质粒均为线性分子,按照分子量大小依次命名为pSAL1、pSAL2.并对不吸水链霉菌梧州新亚种的限制-修饰系统进行初步探讨:将来自变铅青链霉菌TK54的高拷贝质粒pIJ702转化不吸水链霉菌梧州新亚种原生质体,未能得到转化子,改用pIJ702转化不吸水链霉菌梧州新亚种U-3原生质体,得到了转化子.     

尿道致病性大肠杆菌U17株rstA缺失株降低对小鼠的致病性

【目的】探究双组份系统RstA/RstB中效应基因rstA对尿道致病性大肠杆菌毒力的影响。【方法】利用λRed重组系统构建UPEC U17 rstA缺失株U17ΔrstA,并构建相应的回复株,通过体内外试验评价rstA基因缺失对UPEC毒力的影响。【结果】生长曲线的测定结果显示,在LB普通培养基中,缺失株生长速度与野生株相似,但在LB贫铁培养基中,缺失株生长速度较野生株相比明显下降;体外环境应激试验结果显示,缺失株在强酸、强碱、高渗透压、尿素、氧化应激等环境压力下的生存能力与野生株相似;菌株生物被膜检测结果显示,缺失株的生物被膜形成能力与野生株相当;荧光定量PCR检测结果显示,rstA基因在贫铁环境下的表达水平较正常条件下显著上调,暗示贫铁环境可能是rstA发挥效应的刺激信号。6周龄BALB/c小鼠尿道感染试验结果显示,rstA缺失株在尿液、膀胱、肾脏中的带菌量显著低于野生株,而回复株毒力恢复至野生株水平,表明rstA缺失能显著降低UPECU17的毒力。【结论】rstA与尿道致病性大肠杆菌的致病性相关,为潜在的毒力因子。     

致犊牛脑膜炎大肠杆菌新疆分离株ibeB基因的特性分析北大核心CSCD

【目的】分析致犊牛脑膜炎大肠杆菌分离株ibeB基因的分子生物学信息。【方法】以自脑炎死亡犊牛脑组织、肝组织分离鉴定的O161-K99-STa致病性大肠杆菌牛-EN株和牛-EG分离株为材料。根据GenBank中公布的脑膜炎大肠杆菌K1株RS218 ibeB基因序列设计1对引物,采用PCR方法,从分离株中成功克隆ibe B基因,比较分离株ibeB基因与不同来源大肠杆菌ibeB基因的部分生物信息学特性。【结果】分离株ibeB基因序列全长1500 bp,包含1371 bp开放阅读框,共编码457个氨基酸;生物信息学分析显示,牛-EN株与致人脑膜炎大肠杆菌K1 RS218的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%和96.9%,牛-EG株与大肠杆菌K12的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4%和100.0%;ibeB蛋白为亲水性蛋白,分子质量为50.26 kDa,理论等电点为6.05;该蛋白无跨膜区,但具有信号肽序列;亚细胞定位显示,分泌信号通路位点(SP)占比例为0.939,说明该蛋白属于分泌型蛋白。【结论】从致脑膜炎大肠杆菌分离株中成功克隆ibeB基因,该基因与致人脑膜炎大肠杆菌K1 RS218 ibeB基因有较高的同源性,均有相似的生物学特性,属肠外致病性大肠杆菌。     

和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

Construction of a functional network for common DNA damage responses in Escherichia coli

In this study, we aim to identify a common, general mode of toxic action in Escherichia coli when experiencing DNA damage, irrespective of the agents used. We conducted or collected 69 microarray data from seven different DNA damaging agents. In a quantitative manner, we constructed a probable DNA damage stress network, entitled the ‘Functional Linked Network (FLN)’, which consists of 399 significantly perturbed genes and the 1283 interactions among them. The SOS response related genes (LexA modules) were found to be dominantly activated by DNA damage, irrespective of the agents. Several minor, plausible modules were also implicated in this network, and appear to be related with the metabolic inhibition response to DNA damage or mediate the induction of SOS response. This systems and comparison approach across a variety of genotoxic agents may serve as a starting point to specify some of the unknown and common features of DNA damage responses in bacteria.     

一株新型旱獭源性宽谱大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及基因组分析

[目的]分离喜马拉雅旱獭肠内容物样本中的噬菌体,并研究其生物学特性和基因组特征。[方法]以大肠杆菌为宿主菌,利用双层琼脂平板法从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离噬菌体;用透射电镜观察形态特征;测定其最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱耐受度及宿主裂解谱等生物学特性,并进行全基因组测序。[结果]从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离得到一株裂解性大肠杆菌噬菌体,命名为vB_EcoM_TH18,其噬菌斑呈无晕环的透亮圆形,透射电镜观察发现该噬菌体头部直径为(90±5) nm,尾部长度为(115±5) nm;最佳感染复数为1;一步生长曲线显示其潜伏期为10 min,110 min后进入平台期,平均裂解量为15 PFU/mL;在pH 4.5-9.5的范围内具有稳定活性;可裂解多种致病型和血清型大肠杆菌和宋内志贺氏菌,无法裂解沙门氏菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌及鲍曼不动杆菌;基因组测序结果表明,其基因组长度为133 882 bp,GC含量为39.95%。基因组共注释到210个编码序列(CDS)和13个tRNAs,不含毒力基因及耐药基因。BLASTn比对结果表明该基因组与Avunavirus属噬菌体Av-05同源性为95.17%。基于噬菌体全基因组、主要衣壳蛋白和终止酶大亚基分别构建系统进化树,结果表明vB_EcoM_TH18是一株肌尾噬菌体科(Myoviridae) Avunavirus属的新型噬菌体。[结论]从喜马拉雅旱獭肠内容物中成功分离并鉴定了一株新型宽谱大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_TH18,可裂解多种致病型和血清型的大肠杆菌及宋内志贺菌。     

大肠杆菌中转录-翻译耦合的机制

在大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli）等原核生物中,转录和翻译往往是耦合的,这种耦合通常表现在转录和翻译的互相调控上,如转录极性、转录衰减和转录-翻译速率的同步。间接耦合和物理耦合是耦合的两种模式。由警报素（alarmone）(p)ppGpp维持的间接耦合可能需要DksA和TufA蛋白的辅助。物理耦合分为NusG或RfaH因子介导的耦合和非因子条件下产生的“碰撞”耦合。响应于压力的转录或翻译的变化会引发几种耦合模式间的相互转变。耦合对于基因正常表达是必要的,其解除将引发转录终止、R环形成、复制-转录冲突、mRNA切割等不利的事件。结构生物学的相关技术已经清晰地展示了部分耦合的表达体（expressome）的结构细节和特征,这些技术联合多组学分析等方法将提供关于耦合的更深层次的见解。重要的是,对耦合的研究或许会为靶向抗菌药物的开发带来新的思路。     

双组分系统rcsC基因影响禽致病性大肠杆菌的致病性及相关生物学特性

【目的】双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等。本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响。【方法】采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异。【结果】rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强。凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降。细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响。动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力。荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高。【结论】RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力。     

Nucleotide sequence of the FokI restriction-modification system: separate strand-specificity domains in the methyltransferase

The genes for FokI, a type-IIS restriction-modification system from Flavobacterium okeanokoites (asymmetric recognition sequence: 5'-GGATG/3'-CCTAC), were cloned into Escherichia coli. Recombinants carrying the fokIR and fokIM genes were found to modify their DNA completely, and to restrict lambdoid phages weakly. The nt sequences of the genes were determined, and the probable start codons were confirmed by aa sequencing. The FokI endonuclease (R · FokI) and methyltransferase (M · FokI are encoded by single, adjacent genes, aligned in the same orientation, in the order M then R. The genes are large by the standards of type-II systems, 1.9 kb for the M gene, and 1.7 kb for the R gene. Preceding each gene is a pair of FokI recognition sites; it is conceivable that interactions between the sites and the FokI proteins could regulate expression of the genes. The aa sequences of the N- and C-terminal halves of M · FokI are similar to one another, and to certain other DNA-adenine methyltransferases, suggesting that the enzyme has a ‘tandem’ structure, such as could have arisen by the fusion of a pair of adjacent, ancestral M genes. Truncated derivatives of M · FokI were constructed by deleting the 5'- or 3' -ends of the fokIM gene. Deleting most of the C-terminus of M · FokI produced derivatives that methylated only the top (GGATG) strand of the recognition sequence. Conversely, deleting most of the N-terminus produced derivatives that methylated only the bottom (CATCC) strand of the recognition sequence. These results indicate that the domains in M · FokI for methylating the two strands of the recognition sequence are largely separate.     

Recombinant streptokinase production by fed-batch cultivation of Escherichia coli

Streptokinase (SK) is a specific effective medicine for thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. This study established a process for the pilot production of recombinant streptokinase (r-SK). Engineering bacteria were fermented in a 20-l fermentor to produce r-SK. After simple renaturation and purification, 12.9 g of r-SK with 97.8% of purity and about 10⁵ IU mg⁻¹ of specific activity was obtained, the yield of protein and the recovery of activity were 44.9% and 51%, respectively. Finally, the r-SK was made into about 700 doses of injections for clinical applications.     

大肠杆菌的耐酸机制及其改造研究进展

微生物细胞在自然环境或工业应用中经常受到酸胁迫,严重制约细胞生长性能和产物合成效率。为了在各种酸性环境中生存,耐酸细菌发展出多种保护机制来维持细胞内pH稳态,如氢离子消耗、细胞膜保护、代谢修饰等。因此,深入研究耐酸机制、改进菌株耐酸能力对于利用微生物发酵合成高附加值产品具有重要意义。作为模式微生物,大肠杆菌耐酸机制的研究较为透彻,近年来其耐酸性改造也取得了重大进展。本文主要总结了大肠杆菌的氧化或葡萄糖抑制系统(acid resistance system 1, AR1)、谷氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 2, AR2)、精氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 3, AR3)、赖氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 4, AR4)和鸟氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 5, AR5)、细胞膜保护以及生物大分子修复等方面的耐酸机制,并概述了利用传统代谢工程、全局转录工程和适应性实验室进化等方法构建大肠杆菌耐酸菌株的研究进展,同时展望了大肠杆菌耐酸机制及其改造的后续研究方向...