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1.
《生命科学研究》2017,(3)
根据转录组测序结果设计特异性引物,以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)M6-22的c DNA为模板,PCR扩增苹果酸脱氢酶基因MIMDH2,测序结果显示该序列长1 017 bp,编码338个氨基酸。序列分析表明该序列与已报道的烟曲霉(Aspergillus fumigates)线粒体苹果酸脱氢酶的相似性最高,达71.26%,且含有苹果酸脱氢酶的保守辅酶结合位点、底物结合位点和催化活性位点。将MIMDH2片段连接到表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-MIMDH2,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示在50 k D左右处有一蛋白质条带,酶活分析结果显示经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白酶活高达271.33 U/mg。以上结果说明所克隆的MIMDH2为一个新的潜在的苹果酸脱氢酶基因,所编码的蛋白质具有苹果酸脱氢酶的活性。 相似文献
2.
《生命科学研究》2017,(6):482-487
苹果酸酶(malic enzyme,ME)普遍存在于各种生物体中,在二价阳离子(Mg~(2+)或者Mn~(2+))的存在下,它可以催化L-苹果酸进行氧化脱羧反应,产生丙酮酸、CO_2和NADPH。前期分析结果预测红冬孢酵母YM25235菌株具有2个苹果酸酶同功酶基因RKME1和RKME2,而且RKME1基因在15℃低温条件下mRNA转录水平显著提高。为了验证RKME1的结构与功能,以红冬孢酵母YM25235 cDNA为模板,PCR扩增得到大小为1 623 bp的开放阅读框,共编码540个氨基酸。序列分析结果显示该序列含有苹果酸酶保守的4个结构域(Ⅰ~Ⅳ),同源建模结果显示该序列的三级结构和蛔虫中的苹果酸酶晶体结构有较高相似性且高度保守。进一步将RKME1插入到载体pET32a(+)中构建重组表达质粒pET32a-RKME1,然后导入大肠杆菌BL21中进行表达。经IPTG诱导,获得了相对分子质量约为70 kD的蛋白质条带。将该蛋白质进行镍柱亲和层析纯化后,酶活分析的结果表明,重组表达的RKME1蛋白可催化苹果酸脱氢生成丙酮酸,同时生成NADPH,酶活为160 U/mg以上。上述结果表明,RKME1是一个新的苹果酸酶基因,这为深入研究苹果酸酶与红冬孢酵母低温条件下生长适应性之间的关系奠定了基础。 相似文献
3.
把高山被孢霉 (Mortierellaalpina)和深黄被孢霉 (Mortierellaisabellina)的Δ1 2 脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET2 1a中 ,获得重组表达载体pMACL1 2和pMI CL1 2 ,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌BL2 1 (DE3)中。筛选阳性克隆进行培养 ,然后分离其细胞膜蛋白 ,并构建体外表达体系 ,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱 (GC)分析表明 ,分别有 1 7 87%和 1 7 60 %的油酸转化为亚油酸 相似文献
4.
目的:构建人胱硫醚β合成酶(human cystathionineβ-synthase,hCBS)基因原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法:以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因(基因bank号:BT007154.1)完全一致,转入E.coli BL21(DE3)中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果:经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS(rhCBS)。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS(约19 mg/L培养物),并测得其比活力约为57 kU/g。结论:成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。 相似文献
5.
通过5’-RACE获得德国小蠊变应原Bla g 8基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,建立系统进化树,为进一步研究奠定基础。通过5’-RACE技术,PCR扩增获取编码德国小蠊变应原Bla g 8蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法分析预测Bla g 8蛋白的信号肽、疏水性、跨膜区、二级结构、三级结构;建立系统进化树;构建原核表达载体pET32a-B8,IPTG诱导重组蛋白表达,并用His-tag抗体Western blotting验证。结果显示,获得编码德国小蠊变应原Bla g 8的全长cDNA序列,其完整阅读框含618个碱基,编码205个氨基酸。序列分析显示该蛋白,肌球蛋白轻链,具有EF手蛋白保守功能域。IPTG诱导获得重组蛋白。获得德国小蠊Bla g 8的完整cDNA序列,成功构建重组原核表达质粒pET32a-B8,并表达出融合蛋白。 相似文献
6.
深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析 总被引:14,自引:0,他引:14
γ-亚麻酸(GLA,C18:3△^6,9,12)是由△^6-脂肪酸脱氢酶以亚油酸(LA,C18:2△^9,12)为底物,在C6位脱氢形成的。由于在人体中,γ-亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ-亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△^6-脂肪酸脱氢酶的cDNA,全长为1374个核苷酸,编码457个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,△^6-脂肪酸脱氢酶在其序列的N端特有细胞色素b5(Cytb5)区。这是国际上对深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。 相似文献
7.
△12-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
把高山被孢霉(Mortierella alpina)和深黄被孢霉(Monierella isabellina)的△^12-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET21a中,获得重组表达载体pMACL12和pMICL12,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌B121(DE3)中。筛选阳性克隆进行培养,然后分离其细胞膜蛋白,并构建体外表达体系,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱(GC)分析表明,分别有17.87%和17.60%的油酸转化为亚油酸。 相似文献
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9.
《基因组学与应用生物学》2016,(9)
昆虫几丁质酶是昆虫几丁质代谢不可或缺的关键酶类。本研究旨在构建美洲大蠊几丁质酶Pa Cht1基因原核表达载体,纯化并鉴定Pa Cht1重组蛋白,为后续酶活等测定奠定基础。定向克隆Pa Cht1基因成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将构建成功的pET32a-Cht1重组表达质粒导入大肠埃希菌Rosetta中,分别对诱导剂IPTG浓度和诱导时间进行优化,确定最佳诱导浓度和诱导时间,并对表达产物进行可溶性分析。表达产物经镍离子柱纯化后通过Western Blot鉴定。结果表明,美洲大蠊几丁质酶Pa Cht1成熟肽基因编码区长1 083 bp,编码360个氨基酸。最佳诱导浓度和诱导时间分别为0.2 mmol/L和4 h。所得重组蛋白大小约60 k D,与预期结果大小一致,重组蛋白主要以包涵体的形式存在。Western Blot鉴定重组蛋白可与6×His-tag单克隆抗体特异性结合。说明成功构建了原核表达载体pET32a-Cht1,并诱导表达获得了重组几丁质酶蛋白。 相似文献
10.
γ-亚麻酸(GLA,C18:3△6,9,12)是由△6-脂肪酸脱氢酶以亚油酸(LA,C18:2△9,12)为底物,在C6位脱氢形成的。由于在人体中,γ-亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ-亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△6-脂肪酸脱氢酶的cDNA,全长为1374个核苷酸,编码457 个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是, △6-脂肪酸脱氢酶在其序列的 N 端特有细胞色素 b5(Cytb5)区。这是国际上对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。 相似文献
11.
Nava G Laclette JP Bobes R Carrero JC Reyes-Vivas H Enriquez-Flores S Mendoza-Hernández G Plancarte A 《Experimental parasitology》2011,128(3):217-224
We report herein the complete coding sequence of a Taenia solium cytosolic malate dehydrogenase (TscMDH). The cDNA fragment, identified from the T. solium genome project database, encodes a protein of 332 amino acid residues with an estimated molecular weight of 36517 Da. For recombinant expression, the full length coding sequence was cloned into pET23a. After successful expression and enzyme purification, isoelectrofocusing gel electrophoresis allowed to confirm the calculated pI value at 8.1, as deduced from the amino acid sequence. The recombinant protein (r-TscMDH) showed MDH activity of 409 U/mg in the reduction of oxaloacetate, with neither lactate dehydrogenase activity nor NADPH selectivity. Optimum pH for enzyme activity was 7.6 for oxaloacetate reduction and 9.6 for malate oxidation. Kcat values for oxaloacetate, malate, NAD, and NADH were 665, 47, 385, and 962 s−1, respectively. Additionally, a partial characterization of TsMDH gene structure after analysis of a 1.56 Kb genomic contig assembly is also reported. 相似文献
12.
Isolation and expression of the Escherichia coli gene encoding malate dehydrogenase. 总被引:7,自引:3,他引:4
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An oligodeoxynucleotide specific for a pentapeptide sequence corresponding to amino acid residues 32 through 36 of Escherichia coli malate dehydrogenase was chemically synthesized and used to identify the mdh gene on plasmid pLC32-38 from the Clarke-Carbon recombinant library. Cells transformed with this plasmid exhibited a 10-fold increase in malate dehydrogenase activity. A 1.2-kilobase PvuII fragment which hybridized with the oligodeoxynucleotide probe was subcloned, and the identity of the mdh structural gene was confirmed by partial nucleotide sequence analysis. The expression of the mdh gene, as measured by both Northern blotting and enzyme assays, was found to vary over a 20-fold range with different culture conditions. 相似文献
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苹果酸脱氢酶普遍存在于各种生物中,它负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换.根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布及其生理功能的不同,苹果酸脱氢酶在高等植物中可以区分出不同的类型,依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶是其中研究较少的一类.根据已发表的其他高等植物的依赖于NAD的胞质型苹果酸脱氢酶基因的保守序列,运用SMART RACE RT-PCR技术,从玉米叶片中分离了cyMDH 的1 264 bp全长cDNA序列,通过生物信息学分析发现,该序列含有一个999 bp的完整的开放阅读框,其共编码332个氨基酸(GenBank登陆号 EU625276).序列联配与树状分析结果表明,该玉米cyMDH 序列与多个物种的cyMDH 基因具有高度的同源性.组织特异性表达分析显示MDH基因在玉米叶片中表达量最高,在茎、根中亦有低水平表达.本研究将为更深入的研究玉米cyMDH 基因的分子调控机理奠定基础. 相似文献
15.
从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。 相似文献
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Clonorchis sinensis: molecular cloning and functional expression of novel cytosolic malate dehydrogenase 总被引:14,自引:0,他引:14
Zheng N Xu J Wu Z Chen J Hu X Song L Yang G Ji C Chen S Gu S Ying K Yu X 《Experimental parasitology》2005,109(4):220-227
The NAD-dependent cytosolic malate dehydrogenase (cMDH, EC 1.1.1.37) plays a pivotal role in the malate-aspartate shuttle pathway that operates in a metabolic coordination between cytosol and mitochondria, and thus is crucial for the survival and pathogenicity of the parasite. In the high throughput sequencing of the cDNA library constructed from the adult stage of Clonorchis sinensis, a cDNA clone containing 1152bp insert was identified to encode a putative peptide of 329 amino acids possessing more than 50% amino acid sequence identities with the cMDHs from other organisms such as fish, plant, and mammal. But low sequence similarities have been found between this cMDH and mitochondrial malate dehydrogenase as well as glyoxysomal malate dehydrogenase from other organisms. Northern blot analysis showed the size of the C. sinensis cMDH mRNA was 1.2 kb. The cMDH was expressed in Escherichia coli M15 as a His-tag fusion protein and purified by BD TALON metal affinity column. The recombinant cMDH showed high MDH activity of 241 U mg(-1), without lactate dehydrogenase and NADP(H) selectivity. It provides a model for the structure, function analysis, and drug screening on cMDH. 相似文献
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从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化,对纯化蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白具有查尔酮合酶活性,可催化底物4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合生成产物柚皮素查尔酮。 相似文献
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目的:克隆、表达和鉴定肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)P1蛋白羧基端基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法 在成功克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段并测序的基础上,将基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/P1(3 520~4 563bp),转化大肠杆rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用ELISA和Western blotting方法检测其抗原性。重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白质纯度达95%以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。并成功获得两株高效价单克隆抗体。结论:本研究成功克隆和表达了肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,制备了抗肺炎支原体P1蛋白单克隆抗体,为肺炎支原体诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。 相似文献