香菇C_(91-3)转录本Unigene1245基因的克隆表达及其抗肿瘤活性

目的克隆香菇C_(91-3)转录本中Unigene1245基因并进行生物信息学分析,研究其编码蛋白的抗肿瘤活性。方法提取香菇C_(91-3)菌丝体总RNA,反转录合成cDNA,经RACE技术获得Unigene1245基因编码序列,通过NCBI对其进行生物信息学分析。设计特异性引物进行PCR扩增,将其克隆到载体pET-32a(+)上,将重组表达质粒热转化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中,进行目的蛋白的诱导表达、纯化及复性,通过CCK-8法检测其抗肿瘤活性。结果香菇C_(91-3)转录本Unigene1245基因为YjgF/YER057c/UK114家族成员,成功诱导表达其编码蛋白,CCK-8法结果显示该蛋白对人肝癌HepG2细胞的增殖具有一定抑制作用,且具有一定的时间及浓度依赖性。结论成功克隆并诱导表达Unigene1245基因,并鉴定其具有抑制HepG2细胞增殖的能力,为后续探究抗肿瘤机制奠定了基础。     

香菇C_(91-3)转录本Unigene8290基因结构域片段的克隆表达及其抗肿瘤活性初步研究

目的通过对香菇C91-3转录组进行筛选,并克隆表达含RCC1(染色体浓缩调控蛋白)和ANK(锚蛋白)结构域的Unigene8290基因,研究其抗肿瘤活性。方法从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA,反转录合成cDNA,并利用Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)技术获得基因全长。生物信息学分析其结构域。设计特有引物,采用PCR技术扩增该结构域,将其克隆产物与pET-32a(+)载体连接,热转化至E.coil Rosetta-gami(DE3)中诱导表达,纯化、复性后,通过MTT法研究其抗肿瘤活性。结果生物信息学显示Unigene8290基因具有RCC1和ANK结构域,琼脂糖凝胶电泳与测序结果显示Unigene8290基因的结构域片段与pET-32a(+)载体重组成功,SDS-PAGE与Western blot结果显示Unigene8290蛋白成功表达,MTT结果显示该重组融合蛋白对HepG2细胞生长具有明显的抑制作用,并且其抑制作用存在一定的时间和浓度依赖性。结论成功诱导Unigene8290的RCC1和ANK结构域蛋白表达,并初步鉴定其具有抑制HepG2肿瘤细胞增殖活性的功能。     

香菇C_(91-3)转录本Unigene14872基因Pkinase结构域的克隆表达及其生物信息学分析

旨在克隆香菇C91-3转录本Unigene 14872基因中的Pkinase结构域,并对其进行生物信息学分析。提取香菇C91-3菌丝体中总RNA,根据转录组测序结果,用3'-Full RACE、5'-Full RACE方法获得Unigene 14872基因全长。用NCBI对其进行生物信息学分析,预测其具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Pkinase)结构域。设计引物PCR扩增Pkinase结构域,然后克隆至pET32a(+)载体,再热转化至JM109中保存并进行质粒测序。重组质粒pET32a(+)-Pkinase构建成功,并成功诱导表达重组蛋白,初步鉴定该蛋白具有抗肿瘤活性,为进一步研究重组蛋白的活性及作用机制奠定基础。     

香菇C91-3转录本Unigene 24277基因克隆表达及其生物学活性的研究

通过对香菇C_91-3转录本Unigene 24277基因的生物信息学分析,克隆表达含RCC1结构域的Unigene 24277基因,并研究其抗肿瘤活性。从香菇C_91-3菌丝体中提取总RNA,反转录合成cDNA,并利用Rapid Amplification of cDNA Ends（RACE）技术获得基因全长。NCBI数据库分析提示其含有RCC1结构域。PCR扩增RCC1结构域,将其克隆产物与pET-32a（+）载体连接,热转化至E.coil Rosetta-gami（DE3）中诱导表达,纯化、复性后,通过MTT法研究其抗肿瘤活性。结果显示原核表达载体构建成功,重组蛋白成功诱导表达,并初步证明了重组蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖活性的功能,为后续抗肿瘤机制的探究奠定了基础。     

香菇转录本Unigene 10627过氧化物酶结构域的克隆表达及抗氧化活性研究

目的分析香菇C91-3转录本Unigene 10627基因的结构域,并对其进行诱导表达,初步探讨所得目的蛋白的抗氧化活性。方法将香菇C91-3菌丝体中总RNA提取出来,通过反转录获得cDNA文库,根据反转录结果,通过3′-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends),5′-RACE技术扩增获取基因全长。通过生物信息学方法预测基因的结构域,利用PCR技术扩增该目的片段,将扩增产物连接到原核表达载体pET32a(+)上,采用热转化法转至E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行诱导表达,对目的蛋白进行分离、纯化及鉴定。采用二苯代苦味酰自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)法检测蛋白的抗氧化活性。结果成功获得基因全长,预测结果表明该基因具有染料脱色过氧化物酶结构域(DyP_Perox),双酶切结果证实目的片段成功插入,并通过诱导表达获得目的蛋白。结论目的蛋白成功表达,且具有抗氧化活性,为进一步研究其生物学活性提供基础。     

香菇Latcripin-8蛋白的表达、纯化及抗肿瘤活性

目的通过生物信息学方法分析Latcripin-8的基因序列、功能域片段,构建重组质粒,表达含Pkinase结构域基因的目的蛋白并研究重组蛋白的抗肿瘤活性。方法从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA,经反转录成cDNA文库。高通量测序获得转录组mRNA,经对比获得目的序列后以RACE技术扩增。经Pfam数据库比对可知其具有Pkinase结构域。设计引物,PCR扩增并与原核表达载体pET32a(+)进行连接,转至E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行蛋白诱导表达,经纯化、复性后获得目的蛋白并鉴定。CCK8法检测其对人肺腺癌A549细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HepG2细胞及人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率。结果蛋白诱导成功且该蛋白对不同种类的肿瘤细胞抑制效果不同,其中对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制程度最为明显,并表现出时间和浓度依赖性。结论经Latcripin-8基因诱导表达出的蛋白具有抗肿瘤功效,为进一步深入研究抗肿瘤方面的活性提供了初步条件,有助于肿瘤治疗作用的研究。     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

目的通过构建毕赤酵母表达载体将香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中进行表达,同时对表达产物进行鉴定。方法从香菇菌C91-3菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3＇-Full RACE、5＇-Full RACE方法获得24414基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K中,构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414。用电转化的方法将此质粒转化到毕赤酵母GS115中并进行诱导表达,对表达产物用Westen-blot方法进行鉴定。结果通过菌落PCR和基因序列分析确定插入pPIC9K中的片段为24414基因片段,通过Westen-blot方法确定所表达蛋白为目的蛋白。结论重组质粒pPIC9K-24414成功构建,目的凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功表达,为进一步研究香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414的生物学功能奠定了基础。     

香菇C91-3菌凋亡相关基因24414功能域片段原核表达载体的构建

目的构建高效快速且方便的His-标签原核表达体系,对香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域进行克隆。方法根据香菇C91-3凋亡相关基因24414的基因序列,分别设计特异性上下游引物,采用PCR方法,以24414基因序列为模板,扩增出24414基因的功能域序列。并将功能域基因连入pMD19-TSimpleVector克隆载体中,进行蓝白斑筛选,挑选出阳性菌落,提取质粒经双酶切及PCR验证后,进行基因测序。将克隆载体上目的基因连入pET-32a原核表达载体,构建重组质粒。转化入E．coli JM109宿主菌,经双酶切验证后,进一步测序鉴定验证重组质粒。结果PCR扩增出大小为747bp的基因片段,测序结果显示与香菇C91-3,凋亡相关基因24414的功能域片段同源性为100％,并成功构建了原核表达体系。结论重组原核表达载体pET-32a-24414的成功构建为进一步研究香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域的表达纯化及生物学活性奠定了基础。     

人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析

为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。     

苦荞麦FtWRKY28基因克隆及其在低磷与激素诱导下的表达分析

【目的】WRKY转录因子参与植物对低磷胁迫反应的调控。文章基于前期苦荞在低磷胁迫下的转录组数据,克隆FtWRKY28 基因,预测基因及其编码蛋白的序列结构特征,分析基因在各器官中以及在低磷和激素处理下的表达模式,分析蛋白的亚细胞定位与转录激活活性,为阐明基因的生物学功能奠定基础。【方法】基于苦荞基因组数据库注释设计特异引物,用逆转录PCR从低磷处理的苦荞根RNA样中克隆FtWRKY28的完整编码序列,采用生物信息学方法分析基因与蛋白的结构以及同源蛋白的进化关系,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因的表达模式,采用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析蛋白的亚细胞定位,采用酵母单杂交分析蛋白的转录激活活性。【结果】FtWRKY28的完整编码序列长876 bp,编码1个含291个氨基酸、有1个WRKY结构域、锌指结构域为C2H2型的蛋白,归属WRKY家族Ⅱ组。FtWRKY28定位于细胞核,具有转录激活活性。FtWRKY28在根中表达水平最高,受低磷、吲哚乙酸、赤霉素3和6-苄氨基嘌呤显著诱导。【结论】FtWRKY28具有转录因子的基本结构与生物化学特征,可能通过生长素、赤霉素、细胞分裂素信号网络的交互作用,调控苦荞在低磷胁迫下的响应过程。