人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）突变体（2Gly-hGLP-1）与人血清白蛋白（HSA）的融合蛋白。方法：为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸（Ala）定点突变为甘氨酸（Gly）,根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果：融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论：在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。     

重组人骨保护素片段OPG179与人血清白蛋白在毕赤酵母中的融合表达

目的:在毕赤酵母中融合表达人骨保护素(OPG)片段OPG179与人血清白蛋白(HSA).方法:通过RT-PCR扩增获得OPG179基因,构建表达质粒pHILD2-rhOPG179-HSA,转化至毕赤酵母菌中进行表达、纯化,对分泌表达产物进行SDS-PAGE及Western印迹检测.结果:酶切鉴定与测序结果显示重组表达质...     

人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达

为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白。其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h。皮下注射的生物利用度为67.9%。IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景。     

人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

利用重叠PCR技术在体外拼接IFN β和HSA基因,将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNβ-HSA表明该蛋白分子量约为90kDa且具有HSA的抗原性;用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU/ml。     

人血清白蛋白-血管钠肽融合蛋白在毕赤酵母中的表达

人工合成VNP基因,通过酶连构建HSA和VNP基因的融合基因,插入表达载体pPIC9K,电转至毕赤酵母GS115,构建成工程茵,甲醇诱导表达。重组表达质粒经双酶切验证构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析分子量为69 000 Da,与理论值相符;Western blot鉴定产物兼有HSA和VNP免疫原性,说明其为杂合分子;兔胸主动脉环离体灌流实验证明融合蛋白具有舒张血管活性。本研究说明毕赤酵母适于HSA-VNP融合蛋白的表达,为进一步开发稳定的VNP药物提供了生物制备方法。     

虎纹镇痛活性肽在毕赤酵母中的分泌表达

虎纹镇痛活性肽HWAP-Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛初毒中分离纯化,具有镇痛活性的多肽类神经毒素.为了在P.pastoris中高效分泌表达HWAP-Ⅰ,依照RT-PCR的结果,人工合成编码虎纹镇痛活性肽的基因片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,构建表达质粒pPIC9K-HWAP-Ⅰ.转化GS115宿主菌后,筛选出整合型His⁺Mut^S表达菌株.经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)证明HWAP-Ⅰ在毕赤酵母中能有效分泌表达,产物的分子质量为4 ku左右,产量达80 mg/L.体外小鼠输精管阻断实验证实表达产物具有明显的生物活性.     

生长激素释放激素和人血清白蛋白融合蛋白的克隆表达

目的:通过与人血清白蛋白(HSA)融合,延长生长激素释放激素(GHRH)在体内的半衰期。方法:根据毕赤酵母偏爱密码子重新设计GHRH的核酸序列,并通过化学合成和重叠PCR法将GHRH的N端与HSA的C端通过一个11肽的接头连接,获得GHRH和HSA融合的全长基因序列。构建pPIC9-HSA-GHRH表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:克隆了HSA-GHRH融合基因,构建了pPIC9-HSA-GHRH融合表达载体;电击转化后通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌;经分离纯化后,对表达产物的生物学活性分析显示其在体内有促进生长的作用。结论:与人血清白蛋白的融合有效地提高了GHRH的表达水平,并延长了GHRH的半衰期。     

新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化

将含编码HSA天然信号肽、HSA和新型集成干扰素(NIFN)的融合基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC3.5,转染毕赤酵母GS115,用于分泌表达融合蛋白HSA-NIFN的酵母工程菌。诱导表达后,产物经SDS-PAGE、Western blot和MALDI-TOF-MS分析表明该蛋白分子量为86369Da,且能被抗HSA单抗特异性结合;表达的HSA-NIFN经超滤、Blue亲和层析和CM阳离子交换层析纯化后,HSA-NIFN的纯度大于95%。用细胞病变抑制法测定其比活性为7.75±0.39×106IU/mg。     

人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接PTH和HSA基因,并将构建好的融合基因插入到载体pUC19测序后插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOXⅠ和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白PTH-HSA。重组质粒pPIC9K/PTH-HSA经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到的转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到表达; Western blot分析表明发酵液上清中表达的融合蛋白PTH-HSA具有HSA的抗原性:用酶标法测定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为318IU/ml     

TPO模拟肽与人IgG1Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

构建TPO模拟肽与人IgG1Fc融合蛋白的酵母表达体系。利用PCR技术,从重组质粒pET28a-TMPFc中,扩增TPO模拟肽与人IgG1Fc 的DNA片段,连入pPICZαA酵母表达载体,电激法转化毕赤酵母。用MDH和MMH筛选具有正确表型的重组转化子,PCR、蛋白质印迹鉴定融合基因。MTT法鉴定TMPFc对Ba/F3mpl细胞生长的促进作用。构建的重组毕赤酵母实现了TMPFc的分泌表达,表达量占外分泌蛋白质的65%。表达蛋白质的相对分子量约64kD,对Ba/F3mpl生长具有促进作用。TMPFc酵母表达体系表达出可观的二价模拟肽,为二价TMP活性的定量研究奠定基础。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒pPIC9K/VP1,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,甲醇诱导表达。SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为34kD,与天然VP1大小一致。凝胶薄层扫描分析显示:目的蛋白表达量占培养上清总蛋白的60%以上。ELISA实验表明,重组蛋白VP1具有较好的抗原性。使用饱和硫酸铵分级沉淀法初步纯化的表达产物,能够较特异性地与EV71感染者血清中的抗体产生反应,而且与抗柯萨奇病毒A16特异性抗体不产生反应。通过利用表达产物作为抗原,对156份血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的的检测用抗原。     

PTD-NPY融合基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

应用重叠延伸PCR方法扩增HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)与鼠源神经肽Y(NPY)的融合基因,克隆目的片段并插入酵母表达载体pPICZαA,构建成重组表达质粒pPICZα-PTD-NPY.PCR和酶切鉴定及测序正确后,经限制性内切酶Sac Ⅰ线性化重组表达质粒并通过电转化整合到巴斯德毕赤酵母菌GS115的染色体基因组中.阳性重组酵母菌用含1%甲醇的培养基诱导其分泌表达.经过120 h的诱导,取上清浓缩除盐后进行SDS-PAGE电泳,表明该系统成功表达了PTD-NPY融合蛋白,Western blotting实验证实表达产物具有特异性.获得真核表达的PTD-NPY融合蛋白,为下一步的应用研究提供了物质基础.     

毕赤酵母外源基因表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间型和胞内型蛋白质。与酿酒酵母Saccharomyces ceresiviae相比,该系统所具有的很多优势使其应用越来越广泛。有关研究主要涉及以下几个方面：宿主菌株,表达载体,转化方法,外源基因整合,外源蛋白糖基化和高密度发酵培养等。     

分泌型乙型肝炎病毒包膜M蛋白在毕赤酵母中的表达

将乙肝病毒包膜中蛋白M基因插入酵母整合型表达质粒pAO818的醇氧化酶 (AOX1)启动子下游 ,构建携带 8拷贝M表达盒的重组载体 ,经电穿孔转化SMD116 8菌株和G4 18筛选 ,得到了高效分泌表达M蛋白的毕赤酵母菌株 ,表达量超过 5 0mg L .经初步纯化 ,对表达产物的性质鉴定表明 ,重组蛋白具有preS2和S抗原性 ,可以形成颗粒 ,并具有一定程度的糖基化 .所构建的稳定重组菌株和所得到的重组蛋白颗粒 ,为进一步研究新一代的疫苗提供了必要的材料 .     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

重组线虫抗凝肽在毕赤酵母中的表达

目的：获得具有抗凝活性的重组线虫抗凝肽（NAP）蛋白, 为新型抗凝药物的开发奠定基础。方法：将pPIC3.5K-rNAP质粒转化毕赤酵母菌株GS115,筛选出阳性菌株后,用甲醇诱导表达。收集酵母培养上清,用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,通过测定PT(血浆凝血酶原时间)、INR（血浆凝血酶原国际标准化比率）和APTT（活化部分凝血活酶时间）来验证其生物学活性。结果：获得了稳定表达NAP的重组酵母菌株。重组NAP被分泌表达,其分子量比预计分子量（8.7KD）稍大,约为10KD左右,可能与糖基化有关。体外活性检测证实其有较强的抗凝活性。结论：在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的重组线虫抗凝肽,可用于新型抗凝药物的开发。     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达体系是近年发展起来的最为成功的真核表达体系。对巴斯德毕赤酵母表达系统及影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素进行了简要综述。