灰飞虱高带毒（RSV）群体酵母双杂交cDNA文库的构建

为了研究灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén与水稻条纹病毒（rice stripe virus, RSV）互作机制, 本研究构建了灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库。以实验室筛选的灰飞虱高带毒群体为材料, 分离纯化mRNA, 反转录合成双链cDNA, 并连接三框型接头, 层析柱分级纯化。采用同源重组反应制备三框型cDNA入门文库, 再通过同源重组将入门文库转移到Gateway兼容载体pGADT7-DEST上, 构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明： 文库库容量为3.68×10⁷ cfu, 扩增文库滴度为2.62×10¹⁰ cfu/mL; 文库重组率大于95%, cDNA插入片段平均长度>1 kb, 达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。     

镜鲤骨骼肌酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了研究蛋白质之间的相互作用,利用Gateway技术构建了镜鲤(Cyprinus carpio Linnaeus)骨骼肌酵母双杂交cDNA文库.经检测表明,构建的初级cDNA文库的库容量为8×106CFU;酵母双杂交cDNA文库的库容量为6.64×106CFU,插入片段集中在1-2 kb之间,具有较好的多态性.随机挑取的24个克隆没有空载体,全部发生了重组.较高的库容量、较长的插入片段以及较高的重组率保证了文库的完整性和覆盖度.镜鲤骨骼肌酵母双杂交cDNA文库的构建为克隆全长目的基因及研究影响骨骼肌发育的信号传导通路奠定了基础.     

不同饵料密度和盐度下褶皱臂尾轮虫的生活史特征

为探索低盐驯化褶皱臂尾轮虫规模化培育的可行性,本实验以小球藻(Chlorella vulgaris)为饵料,在饵料密度1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷和1.0×10⁸ cells·mL^-1下,采用单个体培养法,研究了盐度23及盐度6的褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)的生活史特征。结果表明：随着饵料密度的升高,两组盐度轮虫的生殖期、平均寿命、产卵量、生命期望、净生殖率、世代时间和种群内禀增长率均呈现出先升高再降低(P<0.05);盐度6的轮虫在饵料密度1.0×10⁶、1.0×10⁷和1.0×10⁸ cells·mL^-1下的生殖前期显著小于饵料密度1.0×10⁴和1.0×10⁵ cells·mL^-1下的生殖前期(P<0.05);盐度23的轮虫...     

机械伤害和外施茉莉酸对巴西橡胶树次生乳管分化的局部效应及其与茉莉酸分布的关系

采用同位素示踪技术和实验形态学的方法揭示茉莉酸在木本植物巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Mull.Arg.)中的分布和运输的特点,并分析其与机械伤害和外施茉莉酸对巴西橡胶树次生乳管分化的诱导效应之间的关系.外施的茉莉酸进入体内后,在较长时间内大部分集中在施用部位.机械伤害阻止外施的茉莉酸进入体内,同时,又使进入的茉莉酸阻滞在受伤部位的附近.与茉莉酸在草本植物中可以向上和向下运输的情况不同,茉莉酸在木本植物巴西橡胶树中主要是向下运输的.机械伤害和外施茉莉酸对巴西橡胶树次生乳管分化的诱导效应是局部的,只在受伤和施用茉莉酸部位的树皮中诱导次生乳管的形成.机械伤害削弱外源茉莉酸对次生乳管分化的诱导效应,这与机械伤害阻止外源茉莉酸进入有关.研究结果表明,体内高水平的茉莉酸是诱导巴西橡胶树次生乳管分化所必需的.     

盐碱胁迫诱导的猴樟酵母cDNA文库构建及CbP5CS上游调控因子筛选

盐碱土壤环境是限制猴樟引种推广的主要因素，脯氨酸是植物适应盐碱胁迫过程中主要的渗透调节物质，筛选并鉴定出调控脯氨酸合成的转录因子对于猴樟耐盐碱分子机理研究具有重要意义。以猴樟实生苗为材料，在水培培养基础上，采用0 mmol/L和10 mmol/L的Na₂CO₃溶液分别进行处理，选取处理6 h、48 h的根系组织，提取总RNA，构建盐碱胁迫诱导的猴樟根系酵母c DNA文库；以猴樟根系总DNA为模板，克隆CbP5CS启动子序列，采用Y1H酵母单杂交技术筛选出与CbP5CS启动子存在互作的蛋白，并通过高通量测序技术鉴定出调控猴樟脯氨酸合成的转录因子。结果表明，所构建的cDNA文库库容为4.88×10⁷CFU/mL，总克隆数为9.76×10⁷ CFU，文库插入片段平均长度在1 000 bp左右，cDNA片段重组率为100%，符合酵母杂交试验的要求。克隆出的CbP5CS启动子序列长2 012 bp，成功构建出诱饵质粒pHIS2-CbP5CS，利用共转化方法从文库中筛选到31个与CbP5CS互作的EST序列。经...     

机械伤害和外施茉莉酸对巴西橡胶树次生乳管分化的局部效应及其与茉莉酸分布的关系

采用同位素示踪技术和实验形态学的方法揭示茉莉酸在木本植物巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Mull．Arg．)中的分布和运输的特点,并分析其与机械伤害和外施茉莉酸对巴西橡胶树次生乳管分化的诱导效应之间的关系。外施的茉莉酸进入体内后,在较长时间内大部分集中在施用部位。机械伤害阻止外施的茉莉酸进入体内,同时,又使进入的茉莉酸阻滞在受伤部位的附近。与茉莉酸在草本植物中可以向上和向下运输的情况不同,茉莉酸在木本植物巴西橡胶树中主要是向下运输的。机械伤害和外施茉莉酸对巴西橡胶树次生乳管分化的诱导效应是局部的,只在受伤和施用茉莉酸部位的树皮中诱导次生乳管的形成。机械伤害削弱外源茉莉酸对次生乳管分化的诱导效应,这与机械伤害阻止外源茉莉酸进入有关。研究结果表明,体内高水平的茉莉酸是诱导巴西橡胶树次生乳管分化所必需的。     

草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用

旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测,未扩增文库的转化率为1.6×105,文库容量为2.4×106,插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp,文库滴度为7×107 CFU/mL,重组率为98%,此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库,以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验,得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落,未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻组蛋白去乙酰化酶HDA705的互作蛋白

为了解水稻(Oryza sativa)组蛋白去乙酰化酶HDA705的生物学功能,构建了HDA705酵母双杂交诱饵表达载体与双杂交文库,并筛选了与HDA705相互作用的蛋白。结果表明,HDA705的诱饵载体无自激活活性且对酵母无毒性作用,文库的滴度也适合常规的酵母双杂交文库筛选。通过对酵母双杂交文库的筛选,共获得了164个阳性克隆,经DNA测序分析,这些克隆编码47个可能与HDA705相互作用的蛋白,其中包括3个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的(辅)转录因子、6个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有R3H结构域的蛋白以及22种酶类等。这为进一步研究HDA705的生物学功能提供了重要的线索。     

中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库的构建

【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成幼虫膜蛋白cDNA第1链,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5′端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到DH10B感受态细胞,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。【结果】通过FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,经检测,中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的总库容量为1.5×10^7 cfu,文库滴度为3×10^6 cfu/mL,重组率达到100%。【结论】本研究利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,为进一步探究感染中华蜜蜂的病原微生物与宿主蛋白互作研究奠定了基础。     

HeLa细胞cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308的构建

旨在利用酵母双杂交系统构建HeLa细胞的cDNA文库,并构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308。从HeLa细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库。应用PCR技术扩增目的片段CPn0308,并成功克隆该基因到诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒转化酵母菌株AH109后,检测诱饵载体有无自激活和细胞毒性作用。结果显示,文库展现良好的多态性,重组诱饵载体pGBKT7-CPn0308不具有毒性且未自主激活报告基因,说明该文库和诱饵质粒可用于酵母双杂交系统。     

巴西橡胶树HbSIP2互作蛋白的筛选和鉴定

可溶性无机焦磷酸酶在天然橡胶生物合成中具有重要的调控作用,HbSIP2是胶乳中关键的可溶性无机焦磷酸酶基因。为了深入了解HbSIP2调控橡胶生物合成的机理,本研究对HbSIP2互作蛋白进行了筛选和鉴定。结果表明:诱饵载体p GBKT7-Hb SIP2无自激活活性,且对酵母无毒性作用,可以用于酵母文库筛选。将诱饵载体与橡胶树胶乳cDNA文库进行杂交,初步筛选获得20个与HbSIP2互作的蛋白。进一步通过双分子荧光互补实验证实,Hb SIP2能够与橡胶延伸因子发生蛋白互作。本研究结果为HbSIP2调控橡胶生物合成的机理研究提供了重要的理论依据。     

西藏大花红景天RcCATs与RcSODs基因克隆及功能分析

为探究过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)基因家族成员在西藏大花红景天高原恶劣生境适应性中的作用,利用生物信息学和qRT-PCR技术对其RcCATs和RcSODs基因家族成员的序列和表达模式进行了分析,并构建RcCAT和RcSOD1的pYES2.0表达载体与pGBKT7诱饵载体,分别进行了酵母胁迫分析和拟南芥酵母文库中互作蛋白的筛选。结果显示:(1)大花红景天中共有2条RcCAT基因,3条RcSOD基因和1条Cu/Zn SOD铜伴侣基因RcCCS。生物信息学分析显示上述基因的氨基酸序列与其同源基因具有较高的相似性(66.37%～94.51%),且均没有跨膜结构域,亚细胞位置预测RcCATs位于过氧化物酶体,RcSODs和RcCCS位于细胞质或线粒体。(2)qRT-PCR结果显示6个基因在根、茎、叶三个器官中均有表达且主要在叶片中表达,低温胁迫和植物激素ABA对基因表达量的影响显著。(3)酵母胁迫结果显示异源表达RcCAT和RcSOD1基因的阳性酵母菌株在冷、热、盐、碱、重金属和H₂O₂胁迫下的细胞活力均比pYES2.0空载菌株高。(4)通过酵母双杂交共筛选到4个与RcCAT互作明显的基因AtbHLH121(AT3G19860)、AtCPCK2(AT2G23070)、AtGRP4(AT5G50750)和AtRAPTOR1B(AT3G08850),3个与RcSOD1互作明显的基因AtEMB(AT5G11890)、AtMBP2(AT1G52030)和AtRH8(AT4G00660)。综上结果表明,大花红景天能够通过RcCATs和RcSODs基因广泛参与调控其生长发育、胁迫响应等代谢途径来适应高原恶劣的环境。     

酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关.     

嗜吞噬无形体Msp2蛋白与宿主互作靶蛋白筛选及生物信息分析

目的:筛选与嗜吞噬无形体Msp2蛋白互作的THP-1细胞靶蛋白,有助于理解病原体侵袭宿主的分子机理。方法:PCR获得无形体msp2基因克隆到pGBKT7载体上构建诱饵质粒并转化酵母菌株Y2HGold,营养缺陷培养基及蓝白斑实验验证诱饵质粒是否有自激活、毒性;抽提THP-1总RNA,经反转录、Long-distance PCR、同源重组等构建到pGADT7-Rec载体上并转化酵母菌株Y187,鉴定cDNA文库质量;酵母双杂交筛选与无形体Msp2互作的宿主细胞靶蛋白,生物信息学分析蛋白互作可能导致的信号通路变化。结果:成功构建诱饵质粒;cDNA文库容量达4×106克隆,插入片段大小100-3000 bp,且无污染;酵母双杂交获得宿主靶蛋白7个,分别是NADH脱氢酶(泛醌)1α亚体13(NDUFA13)、锌指蛋白36, C3H样2(ZFP36L2)、核糖体蛋白11(RPL11)、前胸腺素α(PTMA)、C19orf10、组织蛋白酶G(CTSG)、核糖体蛋白S25(RPS25);生物信息学分析,互作的宿主靶蛋白主要参与细胞增殖、细胞凋亡、溶酶体成熟及其它一些信号通路等生物学过程。结论:应用酵母双杂交系统初步筛选出与嗜吞噬细胞无形体表面蛋白Msp2互作的宿主细胞靶蛋白,并利用生物信息学初步分析了其参与的生物学过程,为进一步研究病原菌胞内生存分子机制奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选橡胶延长因子REF的互作蛋白

利用酵母双杂交系统,以橡胶树(Hevea brasiliensis)橡胶延长因子基因REF的开放阅读框(ORF)构建无自激活性的诱饵表达载体pBD-GAL4-REF,并筛选以pAD-GAL4-2.1载体构建的橡胶树胶乳cDNA文库,对阳性克隆的cDNA插入片段进行测序及生物学功能分析。通过酵母双杂交筛选,共获得5种可能与REF互作的候选蛋白质,它们分别为与诱饵蛋白REF高度同源的REF家族成员、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)、激发子响应蛋白和泛素耦联酶E2,这表明橡胶延长因子REF除了与自身高度同源蛋白质可能存在相互作用之外,还可能与TCTP和激发子响应蛋白等其它蛋白质发生相互作用。这些结果有助于揭示橡胶粒子的生物学功能。     

橡胶树茉莉酸信号途径相关基因表达与橡胶产量的相关性

割胶促进橡胶树合成天然橡胶与激活乳管细胞的茉莉酸信号途径密切相关,但茉莉酸信号途径关键环节的基因表达水平与干胶产量的相关性尚不清楚。为了找到与产量相关的分子标记,该研究采用qPCR技术,分析了割胶条件下茉莉酸信号途径关键环节的9个相关基因在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981’IRRDB种质乳管细胞中的表达。结果表明:大多魏克汉种质的株次干胶产量显著高于1981’IRRDB种质。在9个基因中,除了HbMYC4和HbMYC5,其余7个基因在大多橡胶树魏克汉种质中的表达量均显著高于1981’IRRDB种质,尤其是HbMYC3基因表达差异性好,与干胶产量相关性高,有望作为橡胶树产量育种的一个分子标记。这对育种周期长的橡胶树产量育种具有实际应用价值。     

酵母双杂交系统筛选与组蛋白去乙酰化酶1相互作用的蛋白质

目的：获得组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）的cDNA并构建为酵母双杂交系统中的饵基因,筛选出与其相互作用的蛋白质。方法：利用RT-PCR方法从人HeLa细胞中克隆出1446bp的cDNA片段,重组入载体pGBKT7得到pGBKT7-HDAC1,转化至酵母菌AH109,检测其对酵母细胞无毒性也无自激活报告基因活性,然后将其与已转入HeLa细胞基因组cDNA文库的酵母菌融合,进行筛选和验证工作。结果：筛选出3个阳性克隆,经免疫共沉淀试验进一步验证,发现仅有1个蛋白能与HDAC1发生相互作用,测序结果表明该蛋白为FHL2。结论：应用酵母双杂交方法筛选出HDAC1的相互作用蛋白FHL2,为进一步研究HDAC1的作用提供了新线索。     

酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白——泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶. 为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验. 以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因（UBA52）的cDNA序列有高度同源性（100％）. GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用. 本实验证明,人泛素-52氨基酸（UBA52）融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白, 它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中.     

鲤疱疹病毒II型ORF25B编码蛋白诱饵载体的构建及其互作蛋白的筛选

【目的】鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失。揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础。【方法】本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列。将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2HGold中。在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2HGold自激活现象和毒性作用。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2HGold与鲫脑组织细胞系(GiCB)cDNA文库杂交。【结果】ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。【结论】本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础。