Denitrifikation bei Hydrogenomonas eutropha Stamm H16

Zusammenfassung Hydrogenomonas eutropha (syn. Alcaligenes eutrophus) Stamm H 16 wächst anaerob mit Fructose und Nitrat bzw. Nitrit. Autotrophanaerobes Wachstum unter einer H₂-CO₂-Atmosphäre (90+10 Vol.-%) mit Nitrat als einzigem Wasserstoff-Acceptor ist minimal.Während des anaeroben Wachstums mit Nitrat sind zwei Phasen zu unterscheiden. In der ersten Phase erfolgt die Zellvermehrung auf Kosten der Reduktion von Nitrat zu Nitrit; dieses wird angehäuft. In der zweiten Phase wird Nitrit unter Bildung von Stickstoff reduziert.Gewaschene, anaerob gewachsene Zellen reduzieren Nitrat und Nitrit unter Bildung von N₂. Stöchiometrische Experimente mit H₂ oder Fructose als H-Donatoren lassen darauf schließen, daß Stickstoff das einzige Produkt der Denitrifikation durch die Zellen ist. Diese Schlußfolgerung wurde durch eine massenspektrometrische Analyse des gebildeten Gases bestätigt. Aerob gewachsene Zellen reduzieren Nitrat nur zu Nitrit. In Gegenwart von Ammonium-Salz gewachsene Zellen reduzieren Nitrat mit sehr geringer Rate.Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß Stamm H 16 über nur eine Nitratreductase verfügt. Die Bildung des Enzyms ist durch Ammonium reprimierbar; O₂ ist ohne Einfluß. Die Nitritreductase fand sich sowohl in der löslichen Fraktion als auch in den gereinigten Partikeln lokalisiert. Das Nitritreductase-System wird nur unter anaeroben Bedingungen gebildet.

---

Denitrification in Hydrogenomonas eutropha strain H16

Summary The hydrogen bacterium Hydrogenomonas eutropha (syn. Alcaligenes eutrophus) strain H 16 is able to grow anaerobically with fructose and nitrate or nitrite, respectively. Autotrophic anaerobic growth under a gas atmosphere of hydrogen and carbon dioxide (90+10 vol-%) with nitrate as the sole hydrogen acceptor is minimal.During anaerobic growth with nitrate as H-acceptor, two growth phases are distinguishable: During the first phase cell growth occurs with the reduction of nitrate to nitrite, which is accumulated; on the second phase nitrite is reduced with the formation of gaseous nitrogen.Washed, anaerobically grown cells reduce nitrate and nitrite with the formation of N₂. Stoichiometric experiments employing hydrogen or fructose as the hydrogen donors are consistent with the conclusion that nitrogen is the sole product of denitrification by these cells. This was confirmed by mass spectrometric analysis of the gas formed. Aerobically grown cells are able to reduce nitrate only to nitrite; when grown in the presence of ammonia, the reduction rate is very low.The results indicate that strain H 16 contains only one nitrate reductase. The formation of this enzyme system is not influenced by oxygen, however, is repressed by ammonia.When employing a purified soluble fraction and particles, nitrite reductases were found in both fractions. The nitrite reductase system is formed only under anaerobic conditions.

---

Abkürzungen MB Methylenblau - PMS Phenazinmethosulfat     

Verwertung von Cytosin und Uracil durch Hydrogenomonas facilis und Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Hydrogenomonas facilis verwertet Thymin, Cytosin und Uracil als N-Quelle, Hydrogenomonas H 16 dagegen nur Cytosin. Durch Hydrogenomonas facilis wird Cytosin vollständig abgebaut, durch Hydrogenomonas H 16 lediglich desaminiert, wobei das entstehende Uracil in der Nährlösung angehäuft wird.In zellfreien Extrakten aus Hydrogenomonas H 16, die mit Cytosin als einziger N-Quelle gewachsen waren, wurde Cytosindesaminase-Aktivität im gekoppelten enzymatischen Test nachgewiesen, wobei Glutaminsäuredehydrogenase als Hilfsenzym diente. Mit Ammoniumchlorid herangezogene Zellen zeigten während der Indubation in Cytosin-haltigem Medium einen 18fachen Anstieg der spezifischen Cytosindesaminase-Aktivität.

---

Utilisation of cytosine and uracil by Hydrogenomonas facilis and Hydrogenomonas H 16

Summary Hydrogenomonas facilis utilizes thymine, cytosine, and uracil as nitrogen sources; Hydrogenomonas H 16, however, only cytosine. Cytosine is completely metabolised by Hydrogenomonas facilis, but is only deaminated by Hydrogenomonas H 16 and the resulting uracil accumulates in the culture medium.Cytosine deaminase activity was demonstrated in cell-free preparations from Hydrogenomonas H 16 which had been grown with cytosine as the sole nitrogen source. Enzyme activity was measured using a coupled enzyme assay in which glutamic acid dehydrogenase served as an accesory enzyme. An 18-fold increase in cytosine deaminase activity was observed in ammonia-grown cells during the incubation in a cytosine containing medium.

     

NADP- und NAD-spezifische Isocitrat-Dehydrogenase in Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16

Zusammenfassung Aus einem Rohextrakt von Hydrogenomonas eutropha Stamm H16-Fructosezellen wurden eine NADP- und eine NAD-spezifische Isocitrat-Dehydrogenase teilweise gereinigt und getrennt. Beide Enzyme sind in ihrer Affinität zum Isocitrat und zu NADP bzw. NAD sehr ähnlich. Beide Enzyme werden durch ATP gehemmt, das NADP-abhängige Enzym wird außerdem durch AMP und ADP aktiviert. Das NAD-abhängige Enzym wird durch NADH₂ gehemmt. Beide Enzyme werden stark gehemmt, wenn Glyoxylat und Oxalacetat gemeinsam dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden.

---

NADP- and NAD-specific isocitrate dehydrogenase in Hydrogenomonas eutropha Strain H 16

Summary From crude extracts of fructose-grown cells of Hydrogenomonas eutropha strain H 16 both a NADP- and a NAD-specific isocitrate dehydrogenase have been separated and partially purified. With respect to their affinity for isocitrate and NADP or NAD, respectively, both enzymes are very similar. Both enzymes are inhibited by ATP, the NADP-dependent enzyme is activated by AMP and ADP in addition. The NAD-specific enzyme is inhibited by NADH₂. Both enzymes are highly inhibited if glyoxylate and oxalacetate are concomitantly added to the enzyme reaction mixture.

---

Verwendete Abkürzungen CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid - DEAE Diäthylaminoäthyl - TCC Tricarbonsäurecyclus - Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan     

Die Sichtbarmachung von Innenstrukturen von Bakterien und anderen Mikroorganismen

Zusammenfassung Es wird eine Methode angegeben, die es ermöglicht, Innenstrukturen in Bakterien und anderen Mikroorganismen sichtbar zu machen. Die Methode besteht erstens in einer Angleichung der Brechungsindizes des Einbettungsmediums und der Mikroorganismenoberflächenschicht, zweitens in der Verwendung eines Dunkelfeldkondensors mit hoher numerischer Apertur, die gestattet, die Apertur des Objektivs weiter auszunutzen und so die Auflösung zu erhöhen. Es werden Mikroaufnahmen gegeben, welche die mit dieser Methode erreichten Ergebnisse zeigen. Es werden Innenstrukturen in Mikroorganismen dargestellt: erstens solche, die auch im gewöhnlichen Dunkelfeld bekannt sind (Milzbrand), zweitens solche, die nur aus gefärbten Präparaten bekannt und sonst nicht sichtbar sind (Diphtheriepolkörnchen), drittens solche, die bisher unbekannt waren (Diphtherie, Proteusbakterien, Mucorsporen).     

Verwertung von Fructose durch Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Hydrogenomonas H 16 wächst gut auf Fructose, kann aber Glucose nicht verwerten. Die Fructoseoxydation wird durch Glucose auch in höheren Konzentrationen nicht beeinflußt. Die im zellfreien Extrakt vorhandene Hexokinase phosphoryliert Glucose, Fructose und Mannose. Durch free space-Versuche wird nachgewiesen, daß Glucose nicht in das Zellinnere transportiert wird. Hydrogenomonas H 16 verhält sich also cryptisch gegenüber Glucose.

---

Summary The only carbohydrate utilized by Hydrogenomonas strain H 16 is fructose. The oxidation of fructose is not influenced by glucose even at high concentrations. Cell-free preparations contain hexokinase which phosphorylated glucose, fructose, and mannose. By means of free-space experiments, it has been demonstrated, that glucose does not enter the cell. Strain H 16 behaves therefore as a cryptic with respect to glucose.

     

Der Biosyntheseweg der RNS-Ribose in Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 und Pseudomonas facilis

Zusammenfassung Die am Fructose- und Gluconatabbau über den Entner-Doudoroff-Weg beteiligten Enzyme sowie die Enzyme des oxydativen Pentosephosphat-Weges wurden in Rohextrakten von Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 und Pseudomonas facilis, sowohl nach autotrophem Wachstum als auch nach heterotrophem Wachstum auf Fructose oder Gluconat, bestimmt. Fructose induziert in H. eutropha alle Enzyme des Entner-Doudoroff-Weges, Gluconat nur die Gluconokinase, die 6-Phosphogluconat-Dehydratase und die 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-Aldolase. Dagegen induzieren in P. facilis beide Substrate den gesamten Enzymsatz. Das Fehlen der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase in H. eutropha und das Vorhandensein einer NAD-abhängigen 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase in P. facilis wurden bestätigt. Die Enzymaktivitäten in voll induzierten, auf Fructose gewachsenen Zellen beider Arten sind ähnlich.Mit beiden Stämmen wurden Einbauexperimente mit U-¹⁴C-, 1-¹⁴C- und 6-¹⁴C-Fructose sowie 1-¹⁴C- und 6-¹⁴C-Gluconat als Substrate durchgeführt. Die Ribose wurde aus der RNS isoliert und durch Lactobacillus plantarum fermentativ in Essigund Milchsäure gespalten. Die spezifische Radioaktivität der einzelnen C-Atome wurde durch schrittweisen Abbau der Säuren, quantitative Bestimmung des dabei entstehenden ¹⁴CO₂ und Messung der darin enthaltenen absoluten Radioaktivität ermittelt.Die Ergebnisse zeigen, daß die Ribose in Stamm H 16 ausschließlich über die nicht-oxydativen Reaktionen des Pentosephosphat-Weges gebildet wird. Die C-Atome 1,2 und 3 des Gluconats tragen nicht signifikant zur Gluconeogenese bei.Das Markierungsmuster der Ribose aus P. facilis ist mit dem von Stamm H 16 nahezu identisch. Die oxydativen Reaktionen des Pentosephosphat-Weges über die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase sind von quantitativ geringerer Bedeutung als die Transaldolase-Transketolase-Reaktionen.

---

The biosynthetic pathway of RNA ribose in Hydrogenomonas eutropha Strain H 16 and Pseudomonas facilis

Summary The enzymes involved in the degradation of fructose and gluconate via the Entner-Doudoroff-pathway as well as those involved in the oxidative pentose phosphate pathway have been determined in crude extracts of Hydrogenomonas eutropha strain H 16 and of Pseudomonas facilis after either autotrophic growth or heterotrophic growth on fructose or gluconate as substrates. In H. eutropha fructose induces all enzymes of the Entner-Doudoroff-pathway, gluconate induces only glucokinase, 6-phosphogluconate dehydratase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase. In contrast, in P. facilis both substrates induce the entire set of enzymes. The absence of 6-phosphogluconate dehydrogenase in H. eutropha and the presence of a NAD-linked 6-phosphogluconate dehydrogenase in P. facilis have been confirmed. Otherwise, the enzyme activities in fully induced fructose grown cells of both species are similar.Incorporation experiments were performed using both bacterial species and employing U-¹⁴C-, 1-¹⁴C-, and 6-¹⁴C-fructose as well as 1-¹⁴C- and 6-¹⁴C-gluconate as substrates. Ribose was isolated from RNA and fermented by Lactobacillus plantarum with the production of acetic and lactic acids. By stepwise degradation of the acids and by quantitative measurement and scintillation counting of the carbon dioxide formed the specific radioactivity of each carbon atom has been determined.The results demonstrate that in strain H 16 ribose is formed exclusively via the non-oxidative reactions of the pentose phosphate pathway. Carbon atoms 1 to 3 of gluconate do not significantly contribute to gluconeogenesis.With P. facilis an almost identical labelling pattern was observed, indicating that the oxidative reactions of the pentose phosphate pathway via 6-phosphogluconate dehydrogenase are quantitatively of minor importance for ribose synthesis than the transaldolase-transketolase reactions.

---

Abkürzungen ATP Adenosin-5-triphosphat - DAP Dihydroxyacetonphosphat - E-4-P Erythrose-4-phosphat - ED Entner-Doudoroff - EDTA Äthylen-diamin-tetraessigsäure - FDP(ase) Fructose-1,6-diphosphat(ase) - F-6-P Fructose-6-phosphat - G-6-P(-DH) Glucose-6-phosphat(-Dehydrogenase) - GAP Glycerinaldehyd-3-phosphat - GDH Glycerin-1-phosphat-Dehydrogenase - GK Gluconokinase - HK Hexokinase - KDPG 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat - LDH Lactat-Dehydrogenase - NAD(H₂) Nicotin-amid-adenin-dinucleotid (reduziert) - NADP(H₂) Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (reduziert) - PGI Phosphoglucose-Isomerase - PP Pentosephosphat - 6-PG(-DH) 6-Phosphogluconat(-Dehydrogenase) - 6-PG-DHT 6-Phosphogluconat-Dehydratase - R-5-P Ribose-5-phosphat - Ru-5-P Ribulose-5-phosphat - Su-7-P Seduheptulose-7-phosphat - TA Transaldolase - TEA Triäthanolaminhydrochlorid - TIM Triosephosphat-Isomerase - TK Transketolase - TPP Thiaminpyrophosphat - Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan - Xu-5-P Xylulose-5-phosphat     

The respiratory chain of Hydrogenomonas H16.

The respiratory chain of Hydrogenomonas H16 is shown to consist of two pathways, one of which has as its oxidase and only cytochrome a high-potential b-type cytochrome which is concluded to be cytochrome o. The Km values for the oxygen of the two pathways are consistent with the high-potential b-type cytochrome functioning as a relatively high-affinity oxidase.     

Eigenschaften der NAD-spezifischen Hydrogenase aus Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Aus zellfreiem Extrakt von Hydrogenomonas H 16 wurde die lösliche Hydrogenase 45 fach bis zu einer spezifischen Aktivität von 36500 E/g Protein angereichert. Das Enzym katalysiert die Reduktion von NAD mit molekularem Wasserstoff. Ein Cofaktorbedürfnis konnte nicht festgestellt werden. Der Einfluß von NADH, ATP, Bicarbonat und Magnesium auf die hydrogenasekatalysierte NAD-Reduktion war unerheblich. Das angereicherte Enzym ist flavin- und pyridinnucleotidfrei und reagiert mit NAD, nicht mit O₂, NADP, FMN, FAD oder Methylenblau. Die drei letztgenannten Wasserstoff-Acceptoren werden lediglich in Gegenwart katalytischer Mengen NAD reduziert. Die lag-Phase der Reduktion von NAD läßt sich durch Vorinkubation des Enzyms mit NADH oder Wasserstoff, nicht jedoch mit NAD eliminieren. Die Hemmung der Hydrogenasereaktion durch Sauerstoff ist gering. Reduzierende Agenzien wie Mercaptoäthanol oder Sulfid setzten die Reaktionsrate herab.Die Michaeliskonstante der löslichen Hydrogenase für molekularen Wasserstoff beträgt K _m ^H2 =1,9·10^–4 M. Die NAD-Konzentration, bei der halbmaximale Aktivität erreicht wird, beträgt [NAD]_{0,5 (V)}=1,3·10^–4 M. Das pH-Optimum wird in 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer bei pH 8,5 und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer bei pH 7,9 erreicht. Unter den angegebenen Bedingungen lag das Temperatur-Optimum bei 36°C. Die Aktivierungsenergie der löslichen Hydrogenase wurde als 10,4 kcal/mol ermittelt.

---

Properties of the NAD-Specific Hydrogenase from Hydrogenomonas H 16

Summary A soluble hydrogenase from cell-free extracts of Hydrogenomonas H 16 has been purified 45-fold up to a specific activity of 36,500 units per g protein. The enzyme catalyzes the reduction of NAD with molecular hydrogen. It does not require cofactors. The NAD-reduction catalyzed by this enzyme is influenced to only a small extent by the presence of NADH, ATP, bicarbonate or magnesium ions. The enzyme is free from flavins and pyridine nucleotides, reacts only with NAD and not with oxygen, NADP, FMN, FAD or methylene blue. FMN, FAD and methylene blue are reduced only in the presence of catalytic amounts of NAD. The lag-phase of the reduction of NAD can be eliminated by preincubating the enzyme in the presence of NADH or molecular hydrogen; NAD is ineffective. The inhibition of the hydrogenase reaction by oxygen is negligible. Reducing agents such as mercaptoethanol or sulfide decreased the reaction rate.The Michaelis constant of the soluble hydrogenase for molecular hydrogen is K _m ^H2 =1.9·10^–4 M. Half maximal activity is attained at a NAD-concentration of [NAD]_{0.5 (V)}=1.3·10^–4 M. The pH-optimum is 8.5 in 0.05 M potassium phosphate buffer and 7.9 in 0.05 M Tris-HCl-buffer; reaction rates were maximal at 36°C under the conditions employed. The activation energy was calculated to be 10.4 kcal/mol.

---

Abkürzungen E Enzymeinheit (mole Substrat/min) - E _x Extinktionsänderung bei der Wellenlänge x nm - Ext._x Extinktion bei der Wellenlänge x nm - KP Kaliumphosphat (KH₂PO₄-K₂HPO₄-Gemisch) - MB Methylenblau - NAD Nicotinamid-adenin-dinucleotid - NADH reduziertes - NAD; TEAE Triäthylaminoäthyl - Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan     

Die Hydroxylierung von Phenylalanin durch Hydrogenomonas eutropha H 16

Zusammenfassung Der Tyrosinbedarf von tyrosinbedürftigen Mutanten von Hydrogenomonas eutropha (Alcaligenes eutrophus) Stamm H 16 (ATCC 17699) läßt sich außer durch l-Tyrosin auch durch l-Phenylalanin befriedigen.Suspensionen intakter Wildtypzellen setzen Phenylalanin zu Tyrosin um und scheiden es in die Nährlösung aus. Da Tyrosin mit etwa der gleichen Rate umgesetzt wird, kommt es zu einer nur vorübergehenden Akkumulation.Durch zellfreie Extrakte wird Phenylalanin in Gegenwart von NAD(P)H₂ und Sauerstoff unter Bildung von Tyrosin hydroxyliert. Die Anfangsrate beträgt 20 E/g Protein. Tyrosin wird mit etwa der gleichen Rate abgebaut. Im Rohextrakt kommt es nach einer anfänglichen Akkumulation von Tyrosin (2–3 mM) zur Einstellung einer steady state-Konzentration, die unter 1 mM liegt. Die Phenylalanin-Hydroxylase benötigt außer den genannten Komponenten noch wenigstens einen dialysierbaren, durch Chromatographie an Sephadex-G 25 abtrennbaren Cofaktor.Phenylalanin-Hydroxylase wird in Stamm H 16 durch l-Phenylalanin induziert, nicht durch l-Tyrosin, Phenylpyruvat, Hydroxyphenylpyruvat oder l-Tryptophan. Phenylalanin wirkt nur induzierend, wenn es der Nährlösung in Substratkonzentrationen (0,2%) beigefügt wird, nicht hingegen in Supplinkonzentrationen (20 g/ml).Phenylalanin-Hydroxylase ließ sich nur in den Stämmen nachweisen, die auf Phenylalanin als C- und Energiequelle wachsen (Hydrogenomonas eutropha H 16, Pseudomonas facilis, Stamm 12 X), nicht in einigen anderen geprüften Stämmen.

---

Hydroxylation of phenylalanine by Hydrogenomonas eutropha H 16

Summary The tyrosine requirement of tyrosine-dependent mutants of Hydrogenomonas eutropha (Alcaligenes eutrophus) strain H 16 (ATCC 17699) can be satisfied by l-tyrosine as well as by l-phenylalanine.Tyrosine is formed from l-phenylalanine by suspensions of intact wild type cells and is excreted into the medium. It is only transiently accumulated in the medium since it is further metabolized by the cells at a rate comparable to that of phenylalanine.Phenylalanine is converted to tyrosine by cell-free extracts in the presence of NAD(P)H₂ and oxygen; the initial rate of tyrosine formation is 20 units per g protein. Tyrosine is degraded at an approximately equal rate. After the addition of l-phenylalanine to the crude extract tyrosine is formed and accumulated up to a 2–3 mM concentration and reaches a steady state concentration of less than 1 mM tyrosine. In addition to the components mentioned, the phenylalanine hydroxylase reaction requires at least one dialysable cofactor which has been separated by chromatography on sephadex-G 25.In strain H 16 phenylalanine hydroxylase is induced by l-phenylalanine; it is not induced by l-tyrosine, phenylpyruvate, hydroxyphenylpyruvate or l-tryptophan. Induction occurs only when phenylalanine is added to the growth medium in substrate concentrations (e.g. 0.2%); growth factor concentrations (20 g/ml) are not effective.Phenylalanine hydroxylase has been found only in those strains which are able to utilize phenylalanine as a carbon and energy source for growth: H. eutropha H 16, Pseudomonas facilis, strain 12X.