利用蛋白质组学方法筛选及确定喉癌诊断的标志分子

采用蛋白质芯片和生物信息学方法从喉癌患者血清中筛选标志蛋白. 采用SELDI(surfaced enhanced laser desorption/ionization)蛋白质芯片技术对33例喉癌(12例声门癌, 18例声门上癌, 3例声门下癌)病人血清和31例正常人血清蛋白质谱图进行了检测. PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取数据, 获得的结果采用Ciphergen 公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析. 结果显示与正常人血清蛋白质谱相比时, 喉癌病人血清中有16个差异蛋白, 其中8个标志分子在病人血清中高表达, 8个标志分子在病人血清中低表达. Biomarker Pattern软件在设定条件下自动选取上述标志分子中的两个蛋白质8153和2035 Da用于建立喉癌诊断的分类树模型. 此分类树具有两层3个叶结点, 可将96.9%的喉癌病人和96.7%正常人正确划分出来. 实验证明利用蛋白质组学和生物信息学方法可从血清中筛选出喉癌相关的标志蛋白, 而且蛋白质芯片技术对于发现和筛选血清中的喉癌标志蛋白是一种有效、快速的工具.     

Discovery and identification of Serum Amyloid A pro-tein elevated in lung cancer serum

Two hundred and eighteen serum samples from 175 lung cancer patients and 43 healthy individuals were analyzed by using Surface Enhaced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrome-try (SELDI-TOF-MS). The data analyzed by both Biomarker Wizard™ and Biomarker Patterns™ software showed that a protein peak with the molecular weight of 11.6 kDa significantly increased in lung cancer. Meanwhile,the level of this biomarker was progressively increased with the clinical stages of lung cancer. The candidate biomarker was then obtained from tricine one-dimensional sodium dodecyl sul-fate-polyacrylamide gel electrophoresis by matching the molecular weight with peaks on WCX2 chips and was identified as Serum Amyloid A protein (SAA) by MALDI/MS-MS and database searching. It was further validated in the same serum samples by immunoprecipitation with commercial SAA antibody. To confirm the SAA differential expression in lung cancer patients, the same set of serum samples was measured by ELISA assay. The result showed that at the cutoff point 0.446（OD value）on the Receiver Operating Characteristic (ROC) curve, SAA could better discriminate lung cancer from healthy indi-viduals with sensitivity of 84.1% and specificity of 80%. These findings demonstrated that SAA could be characterized as a biomarker related to pathological stages of lung cancer.     

肺癌病人血清中U1-A snRNP自身抗体的发现与鉴定

许多研究表明, 肺癌病人存在自身免疫现象. 为了寻找肺癌病人血清中具有潜在诊断价值的自身抗体, 采用免疫荧光染色, 免疫印迹和蛋白质芯片技术对10例肺癌病人和10例正常人血清进行了检测. 筛选中发现1例来自64岁男性肺鳞癌(Ⅲb期)病人的血清呈现特异性的细胞核染色, 并在31 kD处有一个明显的细胞核蛋白免疫印迹条带. 进而采用该病人的血清进行免疫沉淀, 对所捕获的蛋白组分进行质谱分析和数据库查询后确认31 kD条带为核内小核糖体蛋白U1-A(small nuclear ribonucleoprotein U1-A, U1-A snRNP). 进一步对36例鳞癌、26例腺癌、31例小细胞肺癌和20例健康对照血清样本进行了免疫荧光染色和免疫印迹验证, 结果显示50%的鳞癌、26.9%的腺癌、54.8%的小细胞肺癌病人血清中有抗U1-A snRNP抗体. 上述结果报道了在肺癌病人血清中出现Anti-U1-A snRNP自身抗体.     

应用蛋白质芯片技术从血清中筛选肺癌标志蛋白

探讨用蛋白质芯片技术筛选肺癌病人血清中的特异性标志蛋白. 采用SELDI (surfaced enhanced laser desorption/ionization)蛋白芯片技术检测了30例肺癌(15例原发癌, 9例转移癌, 6例化疗后)病人血清和12例正常人血清中的蛋白质谱. 选用阴离子交换柱处理血清样品, 用5个不同pH的洗脱液和有机溶剂洗脱柱床, 通过改变洗脱液的pH值得到6个具有不同pI的蛋白质组分. 每个组分用IMAC-Cu和WCX2两种芯片检测. 采用美国Ciphergen 生物公司研制的蛋白质芯片阅读机读取数据, 获得的蛋白质谱采用Ciphergen 公司的Biomark Wizard软件分析. 结果显示, 肺癌病人与正常人的血清中有15个差异蛋白(标志分子)表达. 与正常人血清相比, 6个蛋白质在肺癌病人血清中高表达, 9个蛋白质在肺癌病人血清中低表达. 采用单一标志分子检测时, 敏感性为44.82%~93.1%, 特异性为85%~94.4%. 其中5个标志分子在两种芯片上被检测出来. 实验证明与肺癌相关的特异性标志分子可从病人血清中检测出来, 而且蛋白质芯片技术对于发现和筛选血清中的肺癌标志蛋白是一种有效、快速的工具.     

黑曲霉糖化酶cis调控区上两个CCAAT框协同参与基因启动子的转录激活作用

已报道的EMSA和Footprinting试验表明黑曲霉Aspergillus niger T21糖化酶基因glaA启动子区−489~−414 bp及−390~−345 bp (分别简称为DC, PC)是与蛋白粗提液中同一蛋白因子结合, 并均含有CCAAT五核苷酸的序列. 对DC, PC在糖化酶表达调控中的作用进行了分析. 用CGTAA取代CCAAT, 获得突变体DCm, PCm, 两者均丧失体外结合蛋白因子的能力. 突变体的体内分析结果显示, DC和PC中任何一个发生突变或改变DC, PC在原启动子中的相对方向, 则启动子的活性下降到基础表达水平. 将多拷贝串联后的DC引入A. niger T21glaA启动子原位, 则内源糖化酶的表达和由该启动子引导的外源uidA基因的表达均发生下降, 但由构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA引导的uidA的表达不受影响, 而且EMSA结果表明不等DC拷贝的A. niger转化子中DNA结合蛋白的含量没有明显变化, 表明多拷贝DC的引入引起了调控蛋白的滴定效应. 从A. niger T21cDNA中克隆到AngHapC基因, 将AngHapC基因引入上述含多拷贝DC而糖化酶低表达的A. niger菌株, AngHapC基因的表达使糖化酶的表达量得到明显回升. 上述结果表明, DC和PC中CCAAT五核苷酸序列为蛋白因子结合所必需, 而且两者必须同时与调控蛋白结合才能发挥促进转录的作用, AngHapC为与DC区域结合的正调节蛋白.     

电针对大鼠胃黏膜损伤修复的血清蛋白质差异表达研究

目的：观察电针胃经穴对大鼠胃黏膜损伤修复的血清蛋白质差异表达,为进一步阐明针刺效应的体液机理提供理论依据。方法：用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI—TOF—MS）技术和WCX2（弱阳离子交换芯片）对正常大鼠血清和电针大鼠血清进行蛋白质指纹图谱检测分析,通过Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System软件判别分析处理数据并结合生物信息学方法筛选差异表达蛋白质。结果：与正常大鼠血清比较,电针大鼠血清蛋白质在质荷比为2000-50000有25个蛋白质峰差异有显著意义,其中有19个标志蛋白在电针胃经大鼠血清中呈现高表达,6个标志蛋白在电针胃经大鼠血清中呈现低表达。结论：电针可促进胃黏膜损伤大鼠血清蛋白质差异表达,这种差异蛋白质可能与电针促进胃黏膜损伤修复效应密切相关。     

家蚕雌性附腺及其Ng突变体蛋白质组双向电泳图谱分析

分别对家蚕（Bombyx mori. L）正常及Ng突变体雌蛾性附腺分泌部组织的蛋白质进行提取,并采用双向凝胶电泳和计算机辅助分析方法,对提取的蛋白质混合物进行分离和比较分析。用银染的方法,平均每张电泳图谱可以分离约700个蛋白质点,其中大部分的蛋白质点分布在pH 4～8范围内,在分子量上主要集中在30～70 kD区域。比较分析发现,有4种蛋白只在正常性附腺组织中特异表达,而有2种蛋白只在Ng突变体的组织中特异表达。另外约有29种蛋白在正常性附腺分泌部组织中的表达水平明显高于Ng突变,而约有15种蛋白在Ng突变体的分泌部组织中表达水平较高。这些差异蛋白质可能与Ng突变的形成和导致这种突变体的性附腺不能正常分泌粘性蛋白的性状有关。     

二花脸和大白猪脂肪leptin和下丘脑中Ob-Rb基因表达的发育性变化

为研究猪脂肪组织中leptin和下丘脑中Ob-Rb基因表达发育性变化的性别差异和品种特点, 分别于出生当天, 3, 20, 30, 45, 90, 120和180日龄随机屠宰二花脸公、母猪, 大白猪公猪各4头, 采集血样、背部皮下脂肪组织和下丘脑. 用放射免疫法测定血清leptin浓度, 用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法, 以18S rRNA作内标, 定量分析脂肪组织中leptin和下丘脑Ob-Rb基因表达的发育性变化, 并进行品种和性别间比较. 结果显示: 脂肪组织中leptin mRNA的表达有明显的发育性变化, 随日龄增加而增高, 母猪显著高于公猪, 二花脸猪显著高于大白猪(P<0.01). 二花脸猪和大白猪血清leptin水平的发育性变化模式基本相同, 随日龄增加而增高, 且与脂肪组织中leptin mRNA表达的发育性变化高度正相关(P<0.05或P<0.01), 有性别和品种差异, 总体上母猪显著高于公猪, 二花脸猪显著高于大白猪(P<0.01). 而下丘脑中Ob-Rb mRNA的表达呈现明显不同的发育及品种特点, 在出生后逐渐下降, 然后逐渐回升, 断乳后又逐渐下降, 二花脸猪在120~180日龄又逐渐回升. 大白猪Ob-Rb的基因表达在总体上高于二花脸猪(P<0.01). 结果提示: 二花脸猪和大白猪血清leptin水平和脂肪组织中leptin的基因表达与脂肪沉积相关.     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在毕赤酵母中的融合表达及其活性研究

为了获得结核分枝杆菌ESAT 6蛋白在毕赤氏酵母中的高效表达 ,将人α-2a干扰素基因、结核分枝杆菌esat-6基因经PCR扩增并加上相应的酶切位点 ,两基因之间的DNA接头编码肠激酶识别的多肽 ,DNA经酶切连接插入分泌型载体pPIC9K ,将重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6用SalⅠ单酶切之后 ,电击转入PichiapastorisSMD1168中 ,采用G418梯度筛选获得高抗性转化子。以甲醇作为诱导物 ,发酵4d后取上清 ,进行SDS PAGE和Westernblot鉴定并分析表达产物的干扰素活性。结果表明 ,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小约为 30kD的融合蛋白 ,表达产物不仅具有较高的干扰素活性 ,而且可以和结核病人血清发生特异性结合 ,为结核病的特异性诊断和结核病新型疫苗的研制打下了基础.     

发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白特异结合宿主细胞60kD SSA/Ro

为了初步探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核蛋白(nucleoprotein,NP)对宿主细胞免疫功能的影响。将SFTSV NP和NSs蛋白的编码基因插入真核表达载体VR1012中,通过免疫共沉淀(IP)、SDS-PAGE、质谱检测及蛋白质免疫印迹等方法寻找宿主细胞中与NP相互作用,同时又与免疫功能有关的蛋白质分子,并利用细胞免疫荧光方法检测SFTSV NP与该分子在细胞中的共定位情况。IP和质谱检测结果显示NP能与免疫功能相关的60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,细胞免疫荧光试验进一步显示NP与60kD SSA/Ro蛋白在细胞质中存在共定位。提示SFTSV可能通过其核蛋白与免疫相关分子60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,从而引起机体一系列的免疫反应和临床症状。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS-PAGE蛋白电泳表明在39.9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以 Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该399kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36.9 kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为疫苗的候选成份提供理论基础。     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bt菌株和41个Bt标准菌株中筛选到39株即约25%的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析,发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89 kD大小的蛋白,其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株,即S101和611,并分别进行vip3A基因的克隆和测序,再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较,结果表明,vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个vip3A基因即vip3AS101和vip3A611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-611,转化到大肠杆菌M15,经1 mmol/L IPTG诱导后均表达89 kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明,Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48%和35%的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-611蛋白和已报道的Vip3A-S184蛋白对初孵斜纹夜蛾 (Spodoptera litura) 幼虫进行生物测定,结果表明,3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异,这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。     

α-1-酸性糖蛋白1在肺癌中的表达及其生物学功能探究

α-1-酸性糖蛋白(alpha-1-acid glycoprotein 1, AGP1)属于orosomucoid家族成员,主要由肝细胞和中性粒细胞分泌,是相对分子质量为23.51 kD的酸性糖蛋白。前期研究发现, AGP1蛋白在早期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者血清中含量下降,有望作为NSCLC早诊标志物,但其在肺癌组织中的表达、具体生物学作用及临床意义尚不清楚。本研究运用GEPIA数据库分析肺癌组织中AGP1 m RNA的表达水平,采用蛋白质印迹法检测AGP1蛋白在肺癌组织和血清中的含量,利用cBioPortal数据库分析AGP1在肺癌组织中的DNA改变频率,利用STRING数据库构建与AGP1蛋白相互作用的蛋白质网络,利用HPA和Kaplan-Meier数据库分析AGP1的表达水平与肺癌患者生存的关系;同时,构建过表达AGP1基因的A549和H157肺癌细胞系,通过CCK-8实验检测过表达AGP1对A549和H157细胞增殖的影响。结果显示:AGP1的m RNA水平在486例肺鳞癌组织中显著下降,在早期肺癌组织和血清中AGP...     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株S184中克隆了2.3 kb大小的vip3A基因并进行了序列分析。将vip3AS184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89 kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19%是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、斜纹夜蛾(S.litura)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3AS184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

SELDI-TOF-MS分析结直肠腺瘤血清蛋白质谱的变化

目的：分析结直肠腺瘤血清蛋白质谱的变化,寻找结直肠腺瘤的特异性生物标志物。方法：采用SELDI-TOF-MS技术（表面增强激光解析电离飞行时间质谱）对比分析31例结直肠腺瘤患者和11例正常人的血清蛋白质谱,用Biomarker Wizard软件对获得的蛋白质谱进行分析。结果：结直肠腺瘤组与正常对照组有24个蛋白峰有差异,其中有三个蛋白峰（8565.84D、8694.51D和5910.50D）的差异非常显著,8565.84D和8694.51D在结直肠腺瘤中高表达,在正常人中低表达,而5910.50D在两组人群中的表达相反。结论：这三个蛋白峰可能为结直肠腺瘤特异性的生物蛋白标志物。     

抗菌蛋白LCⅢ的分离纯化及其部分特性

拮抗细菌Bacillus subtills．A014培养液上清经硫酸铵沉淀后。上CM52阳离子交换层析柱,分离出的峰Ⅲ具有对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzea)特异性抑制活性。进一步用快速液相色谱(FPLc)的Mono s层析柱纯化并命名为抗菌蛋白LcⅢ。此蛋白质的分子量约26915 Da,等电点为9．12。氨基酸组成分析表明富含甘氧酸、苏氨酸,丝氨酸,缺少脯氨酸。经：Edman降解法测出N末端28个氨基酸残基。根据其部分序列用计算机检索NBRF蛋白质文库,与所收入的已知蛋白质没有显著的同源性,表明是一种新的功能蛋白质。     

烟曲霉几丁质酶基因的克隆与表达

Chi4 4是烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)YJ-407产生的一种胞外几丁质酶。通过用真菌几丁质酶保守氨基酸序列与Chi44的N-端序列检索烟曲霉部分基因组序列数据库 ,获得一个编号为contig555的烟曲霉基因组序列 ,可能包含烟曲霉几丁质酶的基因。根据检索结果用RT-PCR方法从烟曲霉YJ-407中克隆到1.4kb的cDNA片段 ,该cDNA的ORF编码一个395个氨基酸的蛋白 ,分子量为43.6kD。对其推导氨基酸序列分析表明该蛋白与其它真菌来源的几丁质酶同源 ,而且活性中心与人巨噬细胞几丁质酶高度同源。该cDNA已在E .coli与PichiapastorisGS115中获得表达 ,分别获得 43kD和44kD的重组蛋白 ,两种重组蛋白均有几丁质酶活性。与野生酶相比 ,大肠杆菌表达的43kD重组酶及Pichia酵母表达的44kD重组酶稳定性下降 ,说明Chi44的糖基化修饰可稳定酶蛋白.     

渗透胁迫下脱水蛋白DHN1在猕猴桃细胞中表达及亚细胞分布的动态变化

以绿色荧光蛋白(GFP)为报告分子, 通过构建DHN1-mGFP4融合蛋白表达载体, 研究了渗透胁迫条件下脱水蛋白DHN1的表达及其亚细胞分布的动态变化. 采用PCR方法在脱水蛋白基因dhn1两端引入XbaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点, 克隆到质粒pBIN-35S mGFP4, 构建DHN1-mGFP4融合蛋白表达载体, 并采用基因枪转化猕猴桃(A. delicisoa)悬浮细胞. 培养10 h后观察到高效表达的GFP绿色荧光, 绿色荧光只出现在细胞核内. 提高培养介质渗透势后, 可以诱导脱水蛋白向细胞质分布(主要集中在质膜周围), 并且增加介质渗透势可以明显缩短细胞质出现绿色荧光的时间. 蛋白合成抑制剂环己亚胺能够抑制细胞质绿色荧光的出现, 暗示细胞质出现的脱水蛋白是诱导产生的结果. ABA可以明显促进细胞质绿色荧光的出现, 并且随着介质渗透势的升高迅速缩短细胞质绿色荧光的出现时间.     

禾谷缢管蚜体内的病毒结合蛋白基因的克隆与原核表达

利用一对特异性引物,用PCR的方法从禾谷缢管蚜体内扩增出了病毒结合蛋白基因,序列测定结果表明其长度 为1647 bp,编码548个氨基酸,与GenBank中的禾谷缢管蚜美国生物型Buchnera groELNT核苷酸序列同源性为97%,氨基酸同源性为97.4%。构建了2个原核表达载体并进行表达得到了69kD融合蛋白和63kD的非融合蛋白。     

疟蚊Anopheles gambiae和A. arabiensis嗅觉结合蛋白基因的鉴定和表达谱分型

嗅觉在疟蚊寄主发现行为过程中起主要作用. 基于生物信息学技术, 对按蚊嗅觉结合蛋白基因进行了全基因组分析, 结果总共鉴定了32条嗅觉结合蛋白(OBP)候选基因序列. 进一步采用半定量反转录聚合酶链反应(semi-quantitative RT-PCR), 以疟蚊激动蛋白基因为内部表达参照标准, 研究了冈比亚按蚊所有嗅觉结合蛋白候选基因的组织特异性表达谱. 结果显示: 其中20个OBP候选基因在嗅觉组织(雌蚊触角)中有强的表达, 这说明OBP在疟蚊嗅觉行为中起重要作用. 还研究了冈比亚按蚊复合体(A. gambiae complex)中两种最重要的疟蚊, 即冈比亚按蚊(A. gambiae)和阿拉伯按蚊(A. arabiensis)的蚊种嗅觉特异性表达型, 结果发现其中12个OBP候选基因显示种间差异表达, 同时发现阿拉伯按蚊触角中OBP的累积相对表达强度高于冈比亚按蚊, 其比例为1441.45︰1314.12. 这可能是由二者的不同寄主偏好行为所致, 因为冈比亚按蚊高度嗜吸人血, 而阿拉伯按蚊则介于嗜吸人血和嗜畜血之间, 因此后者需要表达更多的OBPs以支持其寄主选择行为模式. 疟蚊OBP基因的鉴定及其组织和蚊种特异性表达型的确定, 是分析疟蚊嗅觉探测的分子机制的第一步, 如嗅觉结合蛋白重组表达及其配体鉴定.