食品抗氧剂-D-异抗坏血酸的研究——Ⅱ.产酮产碱菌E54产生2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵条件*

2-酮基-D-葡萄糖酸是合成D-异抗坏血酸(简称异维生素C)的前体。而D-异抗坏血酸及其钠盐是广泛应用于食品工业中的优良抗氧剂。本文通过新种产酮产碱菌使葡萄糖发酵产生2-酮基-D-葡萄糖酸,并对该菌发酵的碳源、氮源、通气量、温度、金属离子等影响作了探讨,通过正交试验确定了产生2-酮基-D-葡萄糖酸最佳种子培养基和发酵培养基。并对该菌的发酵代谢作了初步的观察。     

D-异抗坏血酸间接发酵法的研究——Ⅱ.2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌的发酵

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-Keto-D-gluconic acid)的主要用途是合成D-异抗坏血酸的前体,它还可作显影剂、抗氧剂和速凝剂。本文主要报道2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌发酵条件的研究结果。     

食品抗氧剂-D-异抗坏血酸的研究——Ⅰ.2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌的筛

从199株细菌中筛选出产2-酮基-D-葡萄糖酸的高产菌株2株。产物对葡萄糖的克分子转化率达85.93%、87.56%以上。经生物学鉴定,菌株E301为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),菌株E54为产碱菌属的一个新种,为产酮产碱菌(Alcaligenes ketogenes nov.sp.)。将发酵产物及其转化成的D-异抗坏血酸钠样品经红外吸收光谱比较,结果均与标准品相同。可确定这两株菌的发酵产物确系2-酮基-D-葡萄糖酸钙。     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究——Ⅱ.2,5-DKG产酸菌株发酵条件

本文研究了D-葡萄糖两步串联发酵中前一步菌株的发酵产酸条件。实验结果表明,在含有D-葡萄糖、适量的玉米浆、碳酸钙和磷酸盐的培养基中,摇瓶培养48小时,一株葡萄糖酸杆菌突变株SCB611可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸25—30mg/ml,克分子转化率为25%左右;另一株欧文氏菌突变株SCB247可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸45—50mg/ml,克分子转化率为40%。随发酵时间适当延长,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸可逐渐增高。温度28℃,种龄15小时,接种量10%及良好的通气条件,有利于菌株产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸。     

D-异抗坏血酸钠前体产生菌E54发酵条件的优化

产酮产碱菌E54可利用D-葡萄糖发酵产生2-酮基-葡萄糖酸钙,再经甲酯化和化学转化而得到D-异抗坏血酸钢。通过大量摇瓶和罐上试验,进一步优化了培养基组分,改进了发酵条件,并采用批加工艺提高了投糖浓度。菌株在5L罐中发酵周期36h左右,利用D-葡萄糖浓度18～25g／100ml,充分子转化率达90％左在;在147L罐中发酵周期40h左右,利用D-葡萄糖浓度18～25g／100ml,充分子转化率达90％左右。     

-L-古龙酸的研究—Ⅱ.2,5-DKG产酸菌株发酵条件

本文研究了D-葡萄糖两步串联发酵中前一步菌株的发酵产酸条件。实验结果表明,在含有D-葡萄糖、适量的玉米浆、碳酸钙和磷酸盐的培养基中,摇瓶培养48小时,一株葡萄糖酸杆菌突变株SCB611可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸25—30mg/ml,克分子转化率为25%左右;另一株欧文氏菌突变株SCB247可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸45—50mg/ml,克分子转化率为40%。随发酵时间适当延长,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸可逐渐增高。温度28℃,种龄15小时,接种量10%及良好的通气条件,有利于菌株产生2,     

D-异抗坏血酸钠前体产生菌E54发酵条件的优化

产酮产碱菌E54可利用D-葡萄糖发酵产生2-酮基-葡萄糖酸钙,再经甲酯化和化学转化而得到D-异抗坏血酸钢。通过大量摇瓶和罐上试验,进一步优化了培养基组分,改进了发酵条件,并采用批加工艺提高了投糖浓度。菌株在5L罐中发酵周期36h左右,利用D-葡萄糖浓度18～25g／100ml,充分子转化率达90％左在;在147L罐中发酵周期40h左右,利用D-葡萄糖浓度18～25g／100ml,充分子转化率达90％左右。     

代谢工程改造Gluconobacter suboxydans生产2-酮基-D-葡萄糖酸

2-酮基-D-葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂——D-异抗坏血酸的重要前体。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸再氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标,采用同源重组染色体修饰策略,将编码甘油脱氢酶的基因gldh置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh,将编码山梨醇脱氢酶的基因sdh置换为编码2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶的基因ga-2-dh。经PCR、酶活性显色及发酵产物HPLC检测验证表明:构建的工程菌株gdh和ga-2-dh基因被强化而gldh和sdh被敲除;使用10%的葡萄糖复合培养基,摇瓶发酵72h,工程菌2KGA3发酵液中没有副产物5-酮基-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸的含量终浓度达到72.3 g/L,比野生菌株提高42.2g/L,工程菌和野生菌的2-D-KGA质量转化率分别为72.3%和30.1%,工程菌比野生菌提高1.4倍。构建获得的工程菌,不需要外加抗生素,可以保持稳定遗传,对于工业化规模生产具有一定优势,为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 Ⅲ.SCB3058对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化

棒状杆菌(Corynebactcrium sp.)突变株SCB 3058将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸。含2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的发酵液经表面活性剂SDS处理可直接用作菌株SCB3058的转化底物。D-葡萄糖为最佳碳源,同时作为还原的氢供体。培养基中加入NH.Cl对2-酮基-L-古龙酸的生成有明显的促进作用。转化的最适pH为7.5。摇瓶发酵64小时后,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化率为50mol%。     

玉米浆对Vc二步发酵产2-酮基-L-古龙酸影响的研究

通过在培养基中添加不同量的玉米浆,研究其对氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌）生产Vc前体2-酮基-L-古龙酸的影响,并研究玉米浆成分中的12种主要氨基酸对小菌产酸的影响。结果表明：每100 mL发酵培养基中添加2.5 g左右过滤除菌玉米浆时,2-酮基-L-古龙酸产量高达26.84 mg/mL,小菌活菌数为不添加玉米浆时小菌单菌发酵下的9.74倍。过量玉米浆抑制小菌产酸。12种氨基酸单独与氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养及全部混合后与氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养对产酸及菌体生长无影响。     

D-葡萄糖串联发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺条件

研究了在10L发酵罐中D-葡萄糖串联发酵生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的发酵工艺条件。第一步发酵采用欧文氏菌(Erwinia sp.)的突变株SCB247,培养36小时,可将D-葡萄糖转化成中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸,在发酵液中约累积180mg/ml。第二步发酵采用棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058,可将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸专一性地还原生成2-酮基-L-古龙酸。在细胞生长进入对数生长期后期时,加入经十二烷基硫酸钠处理的第一     

微生物混合培养从D-山梨醇产生维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究

在成功利用SCB329和SCB110混合培养完成从D-山梨醇转化产生2-酮基-L古龙酸的基础上,为了消除副产物和获得高的产量,首先对两菌搭配比例,初始pH值,培养基成分等发酵培养条件进行单因子实验,在此基因上采用L9（3^4)正交实验优化其发酵培养基,其最终的优化培养基的成分为：D-山梨醇9g,玉米浆1.5g,尿素1.5g,磷酸二氢钾0.1g,碳酸钙0.2g。用优化后的培养基发酵,没有检测出副产物2-酮基-D-古龙酸,2-酮基-L-古龙酸产量提高了20%。     

微生物混合培养从D-山梨醇产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究*

在成功利用SCB329和SCB110混合培养完成从D-山梨醇转化产生2-酮基-L-古龙酸的基础上。为了消除副产物和获得高的产量,首先对两菌搭配比例,初始pH值、培养基成分等发酵培养条件进行单因子实验,在此基础上采用L9(3⁴)正交实验优化其发酵培养基,其最终的优化培养基的成分为:D-山梨醇9g,玉米浆1.5g,尿素1.5g,磷酸二氢钾0.1g,碳酸钙0.2g。用优化后的培养基发酵,没有检测出副产物2-酮基-D-古龙酸,2-酮基-L-古龙酸产量提高了20％。     

产酮产碱菌E54生产D-异抗坏血酸钠工艺优化研究的新进展

D-异抗坏液酸钠是一种优良的食品抗氧化剂,工业上大多采用间接发酵法生产,即通过细菌发酵由D-葡萄糖生成前体——2-酮基-D-葡萄糖酸钙,再经甲酯化和化学转化得到D-异抗坏血酸钠。此项工艺虽已很成熟,但目前生产中发酵过程多采用假单孢菌,投糖浓度仅能达到16～18％,且存在着易为噬菌体和杂菌感染的不足。     

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌种子培养基的优选

本文报道2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌种子培养基优选的结果。用生产菌株荧光假单胞菌K1005和球状节杆菌K1022进行试验,其较好的种子培养基为:葡萄糖2%,玉米浆1.0%,尿素0.2%,KH₂PO₄0.1-0.2%,MgSO₄·7H₂O 0.05%,pH7.0。廉价的玉米浆和尿素可以替代昂贵的牛肉膏、蛋白胨和酵母膏。所优选的种子培养基的原材料成本大幅度下降。     

山梨酮脱氢酶模块与酮古龙酸杆菌底盘细胞的适配分析

酮古龙酸杆菌Ketogulonigenium vulgare是维生素C二步混菌发酵过程中的产酸菌。山梨酮脱氢酶(L-sorbosone dehydrogenase,缩写为SNDH)作为维生素C直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)合成的关键酶,其作用机制并不十分清楚。借助全基因组测序抽提2个山梨酮脱氢酶基因,分别位于基因组(缩写为sndhg)和质粒(缩写为sndhp)上。通过工程化改造技术在工业产酸菌中构建山梨酮脱氢酶功能模块,比较其对2-KGA产量的影响。研究发现sndhg过表达对菌株产酸影响不明显,sndhp过表达使菌株明显产生副产物。将sndhg和sndhp分别配合辅因子PQQ合成基因pqq A,分别构建sndhg-pqq A和sndhp-pqq A模块,得到的工程菌株产酸情况与之前的结果大致相同。将4株K.vulgare工程菌株分别与内生芽孢杆菌Bacillus endophyticus混合培养传代50 d后,分离菌株进行混菌发酵,其2-KGA的转化率分别提高了15.4%、179%、0.65%和125%。表明混菌适应性进化策略是一种增加功能模块与底盘细胞适配性,进而快速获得优良性状菌种的有效方法。     

基于组学技术的维生素C二步混菌发酵研究进展

二步发酵法是工业化生产维生素C (vitamin C, Vc)的主要方法,其中第二步由伴生菌与产酸菌(普通生酮基古龙酸菌)组合进行混菌发酵产生Vc前体2-酮基-l-古龙酸(2-keto-l-gluonic acid, 2-KLG)的机制,一直是科研人员研究的重要科学问题。通过高通量基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等组学技术揭示生物系统中各个组分相互作用关系已经成为主要的研究手段。本文对近年来利用组学技术解析Vc混菌发酵中两菌互作关系、解除发酵系统的氧化胁迫、伴生活性物质、产酸菌群体感应、外源添加物、基因工程改造产酸菌促进产2-KLG等方面的研究进行综述,并为进一步的探索和深入研究提供思路。     

氧化葡萄糖酸杆菌中硫辛酸合成模块对维生素C一步混菌发酵的影响

在由氧化葡萄糖酸杆菌和普通生酮古龙酸杆菌构建的维生素C两菌一步发酵体系中,为了强化氧化葡萄糖酸杆菌对普通生酮古龙酸杆菌生长和产酸的促进作用,文中在氧化葡萄糖酸杆菌中构建硫辛酸合成功能模块。由含硫辛酸功能模块的氧化葡萄糖酸杆菌和普通生酮古龙酸杆菌组成的两菌一步体系,能减轻普通生酮古龙酸杆菌单菌培养时的生长抑制,强化两菌的互作关系,使维生素C前体(2-酮基-L-古龙酸,2-KGA)的产量提高到73.34 g/L(对照组为59.09 g/L),醇酸转化率提高到86.0%。研究结果为进一步优化维生素C两菌一步发酵体系提供了新思路。     

D-葡萄糖串联发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸——Ⅱ.菌株SCB3058产生2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究

维生素C(Vitamin C,简称Vc),又称L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)是人体必需的维生素,生理作用广泛,在医药和食品工业上均有重要地位。目前国内厂家多以我国发明的“二步发酵法”进行生产,即以D-山梨醇为原料生产2-酮基-L-古龙酸(以下简称2-KLG),然后制备维生素C。而近年来引起国内外普遍关注的是从D-葡萄糖串联发酵生产2-KLG的新工艺,以及采用基因工程技术,构建直接由D-葡萄糖转化生成2-KLG的基因工程菌的研究(图1)。1987年以来我国学者尹光琳等人采用了欧文氏菌(Erwinia sp.)和棒状杆菌(Corynebacterium sp.)进行串联发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸,并开展了一系列的研究。     

5-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产的工艺条件优化

葡萄糖酸氧化杆菌可将葡萄糖转化为5-酮基-D-葡萄糖酸(5-KGA),而5-KGA是重要食品添加剂L(+)-酒石酸的合成前体。为提高5-KGA产量及其对葡萄糖的转化率,对5-KGA发酵生产的工艺条件进行优化。在摇瓶水平最适的培养基和培养条件下,5-KGA最高产量为19.7 g/L,较优化前提高43.8%。在5 L发酵罐上控制恒定pH值5.5、溶氧浓度15%条件下,5-KGA产量达到46.0 g/L,较摇瓶最高产量提高1.3倍,应用葡萄糖流加工艺,5-KGA最高产量达到75.5 g/L,转化率超过70%,与已见报道的最高水平相比提高了32.0%,为实现微生物发酵生产5-KGA、进而合成L(+)-酒石酸的工业化提供了切实有效的途径。