作用于烟碱乙酰胆碱受体的α~*-芋螺毒素研究进展

芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTx)是由热带海洋中的肉食性软体动物芋螺分泌产生的一大类生物活性肽,它们相对分子质量小,能特异地作用于动物体内各种离子通道和受体,具有巨大的药物开发价值。其中,A-超家族的α-芋螺毒素(α-CTx)是发现最早的且最重要的一类成员,它能特异性作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs),是肌肉或神经型nAChRs的选择性阻断剂。nAChRs与中枢神经系统紊乱如疼痛、成瘾、癌症等多种疾病密切相关。近年来,人们陆续发现其他超家族的芋螺毒素中也有成员可阻断nAChRs,如αA-、αB-、αO-、αC-、αD-、αS-等家族的芋螺毒素。上述能阻断nAChRs的芋螺毒素统称为α~*-芋螺毒素(α~*-CTx)。α~*-芋螺毒素对nAChRs阻断活性的差别与它们的结构有着密切的联系。结合国内外研究现状,对α~*-CTx与nAChRs相互作用的关键位点以及结构与功能的关系进行综述,可为相关研究提供参考。     

金环蛇神经毒素与乙酰胆碱受体结合的特点

进一步纯化了前一工作中从广西省产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒分离的突触后毒素Ⅰ和Ⅱ。以超饱和剂量的毒素Ⅰ或Ⅱ先与从电鳐(Narcine maculata)电器官得到的乙酰胆碱受体(AChR)保温10min 或 lh,再加入~(125)Ⅰ-标记α-银环蛇毒素或~(125)Ⅰ-标记眼镜蛇毒素,继续保温10min 或 lh,由测定与 AChR 结合的放射性强度得知,如以未经毒素Ⅰ或Ⅱ预饱和的放射性强度为100%,则经与其一预饱和者的约为30%,即毒素Ⅰ或Ⅱ只竞争地阻遏了α-银环蛇毒素或眼镜蛇毒素与 AChR 结合能力的2/3左右。文中讨论了存在两种类型 AChR 的可能性。     

α-银环蛇毒素同工毒素基因的克隆和表达

α-银环蛇毒素是存在于银环蛇蛇毒中的一种长链神经毒素,能与神经递质受体特异性结合,因此它不仅是神经信号传导机制研究的重要分子探针,更具有开发治疗某些神经性疾病新型药物的可能性。用SMART技术,反转录合成银环蛇毒腺cDNA,克隆并测定了α-银环蛇毒素基因,得到14种mRNA序列;进而将其中一种新的α-银环蛇毒素基因亚克隆到原核表达载体pQE30a和pGEX-4T-1中,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达,其中带有GST融合蛋白的重组质粒α-BgTX(P22-A31)／pGEX-4T-1在BL21菌株中得到高效表达,表达量占菌总蛋白的30％,可溶形式存在的融合蛋白大于25％。     

拉特罗毒素的结构、受体及促分泌机制

α-拉特罗毒素(α-latrotoxin,α-LTX;也称:α-黑寡妇蜘蛛毒素)是一种从黑寡妇蜘蛛毒液中纯化到的,可以有效地触发神经元轴突终末神经递质的释放和分泌细胞分泌的神经毒素。它在细胞膜上存在三类受体。通过与其受体的结合,α-LTX可以通过对细胞膜的穿孔作用以及受体介导的跨膜信号转导两种方式触发细胞分泌。对α-LTX的促分泌作用机制的研究可以促进人们对分泌及其调节机制的深入认识。     

蝮蛇蛇毒磷脂酶A2肌肉毒素

肌肉坏死是毒蛇咬伤引起的局部症状 ,它会引起永久性组织损伤、肢体残废甚至截肢。在过去的几年中 ,人们对蛇毒蛋白中引起肌肉坏死的成分及其作用模式进行了广泛研究。一些来源于蝮蛇的肌肉毒素被分离和定性 ,并在研究它们的作用机理和肌肉坏死的病理过程方面取得了一些进展 [1～ 3 ]。所有这些肌肉毒素都具有磷脂酶 A2 ( PL A2 )结构 ,但有的不具酶活性。本文对蝮蛇肌肉毒素作简要介绍。1　蝮蛇肌肉毒素的生化特性1 .1　肌肉毒素异构体　　通常具有肌肉损伤活性的蛇毒蛋白都是碱性蛋白。在单一种甚至单一个体的蛇毒蛋白中通常都能发现 P…     

49型玻璃纤维滤纸在测定胆碱能受体中的应用

一些蛇毒的α-毒素能与烟碱样乙酰胆碱受体形成特异的、近于不可逆的复合物。因此可用这些α-毒素的放射性标记物定量测定此受体。但是,首先必须把毒素与受体的结合物和游离的标记毒素分开。Miledi等曾采用Sephadex G-50凝胶过滤法,Meunier等用硫酸铵沉淀法,其他还有超速离心法,透析法等。这些方法工作量都很大,有的敏感性差。Schmidt等用DEAE-Cellulose纸片法测定分离提取的受体,提供了一种简便快速的方法。但有的步骤仍较繁杂,并受离子强度和pH的影响,特别是纸片来源不易,需要进口。本文报道采用国产49型玻璃纤维滤纸代替DEAE-Cellulose纸片测     

α-神经毒素与烟碱型乙酰胆碱受体相互作用的研究进展

α-神经毒素(α-neurotoxin,α-NTX)是眼镜蛇科和海蛇科蛇毒的主要毒性成分之一,属一种非酶类多肽,能以特异的、几乎不可逆的状态与烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)结合。nAChR在生物学、病理学、生理学等方面发挥着重要作用,与感觉、认知、疼痛、保护神经元和递质释放等关系密切。神经型nAChR参与多种脑功能,与多种神经退行性疾病的发生密切相关,如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和精神分裂症(Sz)等。因此,研究α-NTX与nAChR的相互作用关系及其作用机制,对深入研究神经活动机制及相关疾病的治疗机理和寻找新型药物等具有重要意义。对α-NTX、nAChR的结构以及它们之间相互作用的研究进展进行了归纳和评述,对其相互作用位点作了较为详细的介绍。     

动物神经毒肽在受体研究中的应用

动物神经毒肽在受体研究中的应用王建华黄培堂黄翠芳（军事医学科学院生物工程研究所,北京１０００７１）关键词受体动物神经毒肽与受体有关的过程是生命调节过程中的重要环节,受体蛋白的研究鉴定,与具有特异作用和高亲和性结合能力的毒素密切相关。蛇毒、蝎毒、芋螺毒...     

蝮蛇毒的神经毒成分的研究 Ⅲ.蝮蛇毒阻遏神经肌肉传递的作用部位

据报道凡含有神经毒的蛇毒都具有与终板区乙酰胆碱受体结合,从而阻断神经肌肉传递的突触后阻遏作用,其中只有银环蛇毒和澳大利亚虎蛇毒等兼有突触前阻遏作用。本工作对蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒阻遏神经肌肉传递的作用点进行了分析。当小鸡颈二腹肌标本在蝮蛇毒作用下出现传递完全阻遏之后,其肌肉对乙酰胆碱还保持着约50%的敏感性,同时由离子电泳注射法测知,蝮蛇毒能降低大白鼠膈肌终板区的乙酰胆碱敏感性。蝮蛇毒对神经肌肉传递除具有突触后作用外,尚应具有突触前作用。在较低浓度(40～100微克/毫升)蝮蛇毒作用下,小终板电位频率和终板电位的量子含量都有一短暂的增加,然后逐渐下降,但在高浓度下(200微克/毫升),两者在逐渐下降之前均无暂时增加现象。增加溶液中的镁离子浓度或降低钙离子浓度均能使蝮蛇毒引起的神经肌肉完全阻遏的出现时间延长。这些又进一步证实了蝮蛇毒中除含有作用于突触后的成分外,尚含有作用于突触前的成分。从蝮蛇毒中分离神经毒成分的方法已初步建立,根据本工作的启示,再进一步分离突触前毒素的工作已初获成功,有关资料将另行发表。     

肺泡型细胞内表皮生长因子和转化生长因子α、β_1及其受体基因表达的研究

分离培养成年大鼠的肺泡 型细胞 ,通过斑点杂交、原位杂交和免疫组织化学染色 ,研究肺泡 型细胞内表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子 α和 β1 (TGFα、TGFβ1 )及其受体基因的表达。结果显示肺泡 型细胞可表达 EGF、TGFα和TGFβ1 ,也可表达相应的 EGF受体 (EGFR)、TGFβ受体 型和 型 (TβR 、TβR )。表明肺泡 型细胞是合成和分泌 EGF、TGFα和 TGFβ1 的细胞之一 ;细胞凭借其 EGFR、TβR的存在 ,其增殖与分化可能受 EGF、TGFα和 TGFβ1 的旁分泌和自分泌两种途径调控。     

杀虫环对黑胸大蠊神经突触传递的阻遏作用

用电生理糖间隙法研究杀虫环对黑胸大蠊神经突触传递的作用,并以α-银环蛇毒素作比较。结果证明:1)杀虫环阈浓度1×10^-5M即显著地抑制兴奋性突触后电位(EPSP)。作用开始使之阈值递增,此时只有增加刺激强度方可诱出EPSP。2)(虫非)蠊第Ⅵ腹神经节是胆碱能的。已知突触后阻遏剂如α-银环蛇毒素的作用是N型乙酰胆碱受体(n-AchR)的专一性配基,与杀虫环阻遏神经突触的传递颇为相似,二者均不影响突触后神经元的静息电位和动作电位的传导;而杀虫环对非胆磁能的神经肌肉接头则无影响。3)自发突触后电位随杀虫环处理时间的不同而变化。开始自发释放电位的振幅、频率逐渐增加,继之产生持续期较长的阵发性高频发放,以后又逐渐消失。     

特异阻断乙酰胆碱受体的海南产α*-芋螺毒素的研究

国际上被誉为"海洋药物宝库"的芋螺毒素(CTx),具有特异结合动物体内各种离子通道和受体的特殊功能。其中的α*-芋螺毒素(α*-CTxs)能特异性地作用于乙酰胆碱受体(n ACh Rs),对其亚型具有极高的选择性阻断活性。不同的亚基组合形成的各种乙酰胆碱受体亚型,在正常健康状态下和多种疾病状态下起着很重要的生理和病理学功能,这些功能至今尚不很清楚,因而发现和开发各种亚型的选择性分子探针,如α*-CTxs将有助于阐释各个亚型的精细结构和功能。深入研究特异阻断乙酰胆碱受体不同亚型的α*-CTxs的结构与功能,及其与受体相互作用的机理具有很重要的科学意义,将有助于研发出与n ACh Rs相关的多种疑难杂症的治疗药物,包括神经痛、癌症化疗、成瘾、痴呆、重症肌无力、精神分裂症、癫痫、乳腺癌、肺癌、脑脊髓炎,以及其他神经疾病等。近年来,我们实验室经过大量筛选研究,鉴定出5个海南产新颖α*-芋螺毒素,对它们的人工合成、三维结构、作用靶点、与受体相互作用机制、药理药效等进行了深入的研究。现对上述特异阻断乙酰胆碱受体不同亚型的5个海南产α*-芋螺毒素的研究进展和应用前景进行综述。     

中国南海堂皇芋螺毒素基因克隆及两个毒素的合成及活性研究

目的 研究中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)毒素基因序列,为毒素功能研究奠定基础。方法 采用Trizol法提取堂皇芋螺毒腺管的总RNA,应用3’端快速扩增cDNA末端(3’RACE)及巢式PCR技术,获得A、O、J超家族芋螺毒素新序列;或以A家族高度保守的内含子及3’端非翻译区(3’UTR)设计引物,克隆出新的α-芋螺毒素新序列。选择合成毒素ImIIA及Im1.2,测定ImIIA二硫键的连接方式,并测定两种毒素对神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的抑制活性。结果 获得11条毒素前体肽序列,分属A、O1、O2、J3等超家族,其中Im1.95为已报道芋螺毒素,其余为新发现芋螺毒素。ImIIA二硫键连接方式为少见的“C1-C2,C3-C4”,10μmol/L Im1.2、ImIIA对α2β2、α2β4、α4β2、α3β2、α3β4 5个nAChR亚型抑制活性较低。结论 通过基因克隆方法,从堂皇芋螺中获得了11个芋螺毒素,其中10个为新序列,属于A、O1、O2、J3等超家族毒素,Im1.2、ImIIA对神经型nAChR各受体亚型活性较低。     

新芋螺毒素基因的克隆及其遗传进化分析

全世界有约800种芋螺,每种芋螺产生多达2 000种的肽类毒素,这些毒素可以作用于电压门控离子通道(Na+,K+,Ca2+)、配体门控离子通道(n ACh Rs,5-HT3R,NMDAR)、G蛋白偶联受体(神经降压素和血管加压素)和神经递质转运蛋白。虽然已有大量的芋螺毒素通过毒液分离、c DNA克隆和转录组测序获得,但已发现的芋螺毒素不足其总量的0.5%。A-超家族中α-芋螺毒素基因结构包含了一个内含子和被该内含子分开的两个外显子,成熟肽具有标准的4个半胱氨酸骨架(CC-C-C)。本研究利用具有保守性的α-芋螺毒素基因内含子序列,采用多个PCR退火温度,从海南产疣缟芋螺中克隆到了1个新的具有6个半胱氨酸骨架(CC-C-C-CC)的M-超家族芋螺毒素基因和1个含有5个半胱氨酸新颖骨架(CC-C-C-C)的未知新家族芋螺毒素,并对它们的基因结构、成熟肽序列,以及与其他M-超家族芋螺毒素的遗传进化关系进行了深入分析。首次证实保守的α-芋螺毒素基因内含子序列可能存在于其他超家族中。     

两个蛇毒基因克隆及cDNA序列多态性再分析

α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin)是一种突触后神经毒素,广泛存在于眼镜蛇科蛇类的毒腺中,对于该基因cDNA多态性是否真实一直存有争议。本研究从银环蛇基因组DNA中克隆到α-银环蛇毒素基因序列,并对其中5个克隆进行测序和序列比对分析。作为参照,从同一次反转录得到的cDNA混合物中,克隆了蛇毒神经生长因子cDNA,并对其进行测序、比对和突变情况分析。综合各研究组报道的α-银环蛇毒素cDNA序列、α-银环蛇毒素基因序列和神经生长因子cDNA序列的突变情况,发现α-银环蛇毒素cDNA的多态性在基因组模板上不存在对应的变化,因此推测这种多态性不是从不同的转录本而来,同时考虑到不同研究小组报道的序列突变位点并没有出现相同的情况,因此其多样性也不是RNA编辑的结果。可见这种cDNA序列上的多样性很可能是由反转录过程以及基因克隆过程中人为引入的错误造成的。     

基于蛇毒提取物的超级止血粘合剂的发现

正蛇毒可以伤人,也可以救人。它的主要毒性(活性)成分是蛋白质,根据作用部位及原理不同一般分为神经毒素、心脏毒素、凝血毒素、出血毒素等。研究人员分离和研究了多种毒蛇的毒液,目前基于蛇毒毒素也开发出了多种抗癌、镇痛、抗血栓的药物。受蛇毒凝血功能的启发,来自陆军军医大学西南医院联合加拿大曼尼托巴大学的研究团队将从巴西矛头蝮Bothrops atrox的毒液中提取的血凝酶(hemocoagulase,HC)引入明胶-甲基丙烯酸凝胶(Gel MA),     

静脉平滑肌上的α-受体宜分类为突触后α_2-受体

大量实验证明,肾上腺素能神经-效应器接点突触前膜和突触后膜上的α-受体性质不同,Langers首先提出,将调节效应器官反应的突触后α-受体命名为α_1-受体,而将突触前膜上调节NA释放的α-受体命名为α_2-受体。一些药物可选择性地激动或阻断突触前、后两种不同的α-受体。例如,甲氧胺、新福林选择性地激动α_1-受体;可乐宁(clonidine)、托马唑啉(tramazoline)选择性地激动α_2-受体。哌唑嗪(prazosin)主要阻断α_1-受体;育亨宾(yohimbine)主要阻断α_2-受体。在大多数血管,NA激活突触后α-受体,使血管平滑肌收缩,并因此使血管收缩。但并非所有血管平滑肌细胞上的α-受体均属同一亚型。多数离体动脉平滑肌对A、甲氧胺、NA新福林等α-激动剂发生收缩反应,但对可乐宁和托马唑啉相     

蝮蛇神经毒素引起的神经肌肉接头超微结构变化

当小鼠接受6—8微克(皮下注射、超最小致死量)的蝮蛇神经毒素后,一般经1—2小时便因呼吸麻痹而死亡。在中毒早期,即出现呼吸困难症状时所取出的样品中,神经肌肉接头超微结构均正常,但在中毒晚期,即呼吸即将停止之前所取出的样品中,接头前部分发生明显变化,主要是突触泡显著减少,甚至完全被排空,线粒体肿胀、破裂、变性和减少。但神经末梢轴突膜平滑匀整,未见Ω型凹陷的形成,突触裂隙和突触后皱褶亦未见变化。这些结果提示,蝮蛇神经毒素也可能和太攀蛇毒素等相似,通过影响突触泡再循环过程,以阻遏神经肌肉间的传递。文中还讨论了蝮蛇神经毒素与其它蛇毒突触前毒素对接头超微结构作用的异同。     

乙酰胆碱对人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞N受体α亚单位的影响

目的:了解Ach对人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞烟碱型胆碱能受体(N受体)α亚单位数量的影响及两者间的差异.方法:采用免疫组化法检测培养的人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞膜上N受体α亚单位的数量.结果:胃腺癌细胞N受体α亚单位数量、数密度明显高于胃粘膜上皮细胞(P<0.01).Ach使胃粘膜上皮细胞N受体α亚单位的数目、面密度和数密度增加(P<0.01),却使胃腺癌细胞N受体α亚单位数量及面密度减少(P<0.01).结论:Ach对正常细胞和肿瘤细胞的作用机制可能不同.     

蛇毒磷脂酶A_2对血液系统作用研究的新进展

蛇毒磷脂酶Ａ_２对血液系统作用研究的新进展沈阳军区大连第二疗养院王润鹏,詹明磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）是蛇毒的主要组分之一,是有关凝血和溶血、生物活性等功能的重要工具酶,是突触前神经毒素、肌肉毒素、心脏毒素等活性,具有增强和协同效应的主要酶。近年来有关其?..