DNA5′端~(32)P标记方法

在DNA的结构与功能研究中,其5′端~(32)P标记是常用的有效技术。下面我们从《Methods in Enzymolgy》Vol 65中摘译了DNA 5′端脱磷及~(32)P标记方法,供大家参考。1.用磷酸单酯酶除去DNA链5′末端磷     

分子克隆中使用的其他酶(续)

用T_4多核苷酸激酶标记DNA5′端: T_4多核苷酸激酶(T_4感染E.coli)此酶催化ATP之r位磷转移到DNA或RNA的5′OH上的反应。     

大鼠肝和肝癌DNA酶切片段与标记RNA杂交图谱比较

Southern印迹杂交实验提示,大鼠肝15kbp EcoR Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA杂交带强度,大于肝癌DNA相应片段;当以5′-~(32)P标记核RNA和3′-~(32)P标记核RNA代替~(125)Ⅰ标记核RNA时,在肝癌相应DNA片段处几无可见的杂交带。大鼠肝2.4kbp EcoR Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA杂交带明显强于肝癌相应DNA片段。而大鼠肝癌2.0kbp EcoRⅠ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA的杂交带明显强于大鼠肝相应DNA片段。大鼠肝2.2kbp和5kbpBamH Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA或5′-~(32)P标记核RNA或3′-~(32)P标记核RNA的杂交带,均明显高于肝癌相应DNA片段。~(125)Ⅰ标记大鼠肝癌核RNA与大鼠肝和肝癌2.2kbp或1.1kbpEcoR ⅠDNA片段的杂交带,弱于用~(125)Ⅰ标记大鼠肝核RNA为探针得之结果,当以5′-~(32)P标记核RNA代替~(125)Ⅰ标记核RNA为探针时,差异更明显。     

不需要放射性同位素的糖基化DNA探针

在为获得安全、快速、非放射性的DNA标记方法的探索中,我们已研制出用于产生和检测糖基化DNA的程序。此项工作始于葡糖基化DNA(来自T4噬菌体)可被伴刀豆球蛋白(ConA).沉淀这一观察。一种葡萄糖取代的三磷酸胸苷类似物(2′-脱氧尿苷-5-烯丙基胺-麦芽三糖一5′-三磷酸盐)已被合成,并在缺口翻译反应中用于标记DNA。掺入的速度和程度均类似于被代替的三磷酸胸苷。     

植物叶绿体4.5S核糖体rRNA作为分子杂交探针的研究

我们提取纯化了芹菜,菠菜和蕃茄叶绿体核糖体4.5SRNA(4.5SrRNA)并在其5’端标记~(32)P,作为探针与菠菜,蕃茄和芹菜叶绿体DNA(ctDNA)进行分子杂交。结果不仅证明4.5SrRNA可作为公用分子杂交探针,而且也说明不同植物4.5SrRNA序列有相当大的同源性。     

疑难问题解答一例

问:在噬菌体侵染细菌的实验中,怎样知道进入细菌细胞的是噬菌体的DNA而不是蛋白质呢?答:噬菌体是有蛋白质的外壳包裹着DNA的简单结构.它侵染细菌时,进入细胞的是DNA还是蛋白质呢?美国科学家赫尔希(Hersher)和蔡斯(Chase)在1952年做了如下的实验回答了这个问题.他首先将噬菌体培养在含有用~(32)P同位素标记的磷酸盐培养基上,结果DNA被~(32)P标记.而蛋白质一般只是由C、H、O、N、S元素组成,而不含P,故蛋白质不会被标记.他又将噬菌体放在含有~(35)S同位素标记的硫酸盐培养基里培养,结果噬菌体的蛋白质被~(35)S标记上.而DNA没有被标记.     

基于COI基因5′端与3′端序列田间常见粉虱的分子鉴定

【目的】粉虱种类繁多,个体微小,其种类识别与鉴定常需借助分子生物学技术。本研究旨在明确线粒体COI基因(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I gene) 5′端和3′端序列对常见种类粉虱识别鉴定的可行性。【方法】以我国田间常见的16种粉虱为对象,以COI基因5′端(641 bp)和3′端(738 bp)序列为靶标进行比对分析,以MEGA 5.10软件的K2-P模型计算种内与种间遗传距离,以邻接法(NJ法)构建进化树并进行系统发育分析。【结果】当以5′端为靶标时,16种粉虱的种内平均遗传距离为0.0015,种间平均遗传距离为0.2897,种间遗传距离为种内遗传距离的193.1倍;而且种内、种间遗传距离没有重叠区域。当以3′端为靶标时种内平均遗传距离为0.0007,种间平均遗传距离为0.2817,种间遗传距离为种内遗传距离的402.4倍;但桑粉虱Pealius mori与烟粉虱Bemisia tabaci Asia II 1的种内和种间遗传距离重叠。系统发育分析结果显示,以5′端为靶标时,16种粉虱可以形成独立的进化分支;以3′端为靶标时,除桑粉虱与传统分类学不一致外,其余种类均可形成独立的分支。【结论】结果表明,5′端序列更适用于基于DNA条形码技术的物种识别鉴定研究。     

一种DNA扩增的新技术： 利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应

Bst DNA聚合酶具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,在体外DNA等温扩增反应中起重要作用. 本文利用Bst DNA聚合酶的5′→3′聚合酶、核苷酸（末端）转移酶及链置换酶活性发展了一种新的体外环式DNA扩增技术跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)．在SRCA反应中,Bst DNA聚合酶以上游引物P1为模板合成其互补链RcP1,并和P1形成双链DNA|之后,Bst DNA聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1的3′末端沿5′→3′方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸（dNMP)m序列,即DNA的合成反应跨越了RcP1 与下游引物P2之间的缺口|然后,以下游引物P2为模板形成互补序列（RcP2）;接着,Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2的3′末端,形成（dNMP)n序列．继而,Bst DNA聚合酶以RcP1为模板,继续催化聚合反应合成互补新链,并通过其链置换酶活性替换P1|如此往复,形成［P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n …］序列．本文通过电泳、酶切、测序等方法对扩增产物进行分析,演绎出上述扩增过程,并就工作原理进行了讨论．该反应可能对开发等温扩增技术检测微生物有一定助益,也为解释环介导等温扩增技术中假阳性反应和滚环等温扩增反应中的背景信号提供了线索．     

油菜叶绿体4.5S rRNA与高梁ctDNA杂交及作为探针的应用

提取纯化了油菜叶绿体核糖体4.5S RNA(4.5S rRNA)并在其5’端标记 ³²P,作为探针与高梁叶绿体DNA(ctDNA)进行分子杂交。结果证明油菜4.5Sr RNA可作为公用探针,对一般植物,特别是高等植物进行分子杂交研究。杂交的结果得到两条带。     

蒸腾强度对根-土界面磷浓度的影响及其与吸收的关系

玉米在温室中水培至三叶期,以薄层标记、贴根法转移至~(32)P标记土上培育,并在不同蒸腾强度下进行生长。根据Sinha等的方法测定根AFS的~(32)p量。结果表明,蒸腾强度和介质磷浓度对玉米根内总磷浓度有明显影响,其中根AFS~(32)P强度变化尤为突出。光密度计扫描自显影图像的结果说明,由于蒸腾强度不同影响~(32)P吸收,显示出玉米根际微区磷素分布的差异。     

同位素与生物素标记的HCMV DNA探针检测婴儿肝炎综合症血和尿标本的比较

用~(32)P和生物素标记的克隆化的人巨细胞病毒(HCMV)AD169株DNA片段作探针,采用DNA-DNA斑点杂交法,对照检测了27例婴儿肝炎综合症患者(血清学检测为非甲非乙型肝炎者)临床血、尿标本的HCMV-DNA。其中16份血标本呈阳性,占59％;9份尿标本呈阳性,占33％。初步结果表明,血标本中HCMV DNA检出率比尿标本检出率高26％。标记的~(32)P探针可检测10pg同源DNA,生物素探针可检测50Pg同源DNA,均不与其它疱疹病毒及未感染的人胚肺细胞DNA杂交。将其中26份血标本的HCMV DNA杂交结果与抗HCMV IgM ELISA检测结果相比较,符合率为65％。     

用S1核酸酶作图法测定蓖麻蚕18S rRNA基因的5′端位置

测定基因5′端位置是研究基因转录调控的一个重要前提。本文将蓖麻蚕18S rRNA基因DNA的5′端用~(32)P标记,然后与18S rRNA杂交,再用S1核酸酶水解掉非杂交区的DNA和RNA。分析放射自显影的结果,测出18S rRNA基因5′端的位置。在18S rRNA基因的BglⅡ_2位点向EcoRⅠ,方向延伸约220bp处,从这一结果,可知道蓖麻蚕rRNA基因的转录方向是5′EcoRⅠ_2→BglⅡ_23′。     

2′-氟取代对T7 DNA连接酶连接效率的阻滞

为更好地理解连接酶的接合机制,研究了2′-氟取代核苷酸（2′-fluorinated nucleotide, FN）对T7 DNA连接酶接合特性的影响。利用分子信标的荧光信号变化来检测连接酶接合活性。结果显示,在连接酶作用的分子信标缺口处的5′端和3′端分别进行F取代时,对T7 DNA连接酶的接合效果分别阻滞（48.7±6.7）%和（70.6±4.0）%。在取代同时发生在5′端和3′端时,接合效果被阻滞（76.6±1.3）%。动力学参数的回归显示,FN取代会导致连接反应最大速率（Vmax）降低,同时导致米氏常数Km增大,说明酶和底物之间的亲和力在取代后减小。缺口两端的碱基错配也对酶接合反应效果产生一定的阻滞效应。本研究的结果和结论使对氟取代后,T7 DNA连接酶的接合特性有了更进一步的认识,为更好地应用T7 DNA连接酶接合活性提供有力的实用依据。     

~(35)S标记DNA探针检测真核单拷贝基因

本室采用国产[α-~(35)S]dATP制备DNA探针,用于检测真核单拷贝基因并初步获得了满意结果。本文还叙述了~(35)S取代~(32)P中标记DNA探针和Southern吸印杂交时,适宜的反应条件,优点及其意义。     

Red同源重组技术研究进展

伴随着分子生物学的发展,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。     

酶标HBV DNA探针的研制与应用

本实验采用一种非放射性物质——碱性磷酸酶标记乙肝病毒HBV DNA制备分子探针。碱性磷酸酶在苯醌作用下与单链DNA联结,形成DNA和酶的共价复合物,即酶标探针。此探针通过分子杂交与待测DNA结合,与酶的底物作用显色,几小时内可观察结果,其最低检测量约为10pg。用此探针检测乙肝病人血清中的HBV DNA,与~(32)P标记的探针比较,酶标探针可检测出~(32)P标记探针检出率的95.7％。结果表明,所合成的酶标探针具有准确、简便、快速、安全而经济的优点,具有应用前景。     

生物素标记DX_(13)探针及一例甲型血友病家系分析

 以Bio-ll-dUTP替代dTTP经二步法缺口平移标记DNA片段制得生物素DX_(13)探针。其碱性磷酸酶ABC体系显色灵敏度为100fg(约5×10~(-18)mol);与5μg染色体DNA进行Southern印迹杂交,可得清晰的单拷贝杂交区带。以此探针对一血友病家系做RFLP分析,确定两成员为甲型血友病基因携带者。与32P探针对比,两种探针的杂交和分析结果完全一致。表明高标记的生物素探针可应用于单拷贝基因分析和基因诊断。     

~(125)Ⅰ标记HBV-DNA探检测血清乙型肝炎毒DNA

<正> 近年已能对乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)进行测定。作者用~(125)Ⅰ标记的HBV-DNA探针,检测HBV的DNA聚合酶,并同32P标记法所测结果进行比较,探讨~(125)Ⅰ标记法的准确性,现报告如下: 对象和方法:HBV健康携带者8例,慢性肝炎89例,肝硬变11例,肝癌2例共计110例作为受检对象。所有患者HBsAg均阳性,HBeAg阳性83例,抗HBe抗体阳性17例。 HBy-DNA测定步骤是首先使DNA2条链中的1条变性,然后加入~(125)Ⅰ标记HBV-DNA,使其和血清中的1条DNA链杂交。反应液进行柱层析后,将洗出液用r-计数器检测并定量。 结果:HBV-DNA量和HBV-DNA     

抗菌肽AD与haFGF融合基因的合成及其表达

通过PCR技术和体外DNA重组技术将CecropinAD连接在haFGF改构体的5′端,构建成融合基因CADAF。将其克隆到表达载体pET3c上,然后转化到BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。经DNA序列分析,合成的CADAF基因序列与设计序列一致。构建的CADAF基因在BL21(DE3)中获得了表达 。     

萘降解质粒ND1.860和NAH7的DNA同源性研究

通过DNA:DNA杂交技术,用NAH7质粒的全部EcoR Ⅰ片段或ECOR Ⅰ A片段作为~(32)P标记的DNA探针,研究了萘降解质粒ND1.860和NAH7之间的DNA同源性。在ND1.860的9个HindⅢ片段中,5个与NAH7有同源性,其中3个与NAH7的编码萘降解途径的EcoR Ⅰ A片段有同源性。