新型阳离子基因传递载体PEI-PBLG的细胞转染研究

对新型阳离子聚合物PEI(10kD)-PBLG进行研究,重点考察其基因转染效率与细胞毒性,探讨其作为基因载体的可能性。通过粒径分析及扫描电镜(SEM)观察PEI(10kD)-PBLG与质粒pEGFP自组装形成的颗粒形态及粒径,预测其进入细胞的可能性。使用MTT比色法分析PEI(10kD)-PBLG、PEI(25kD)-PBLG、PEI(10kD)和PEI(25kD)的细胞毒性差异。选用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP作为报告基因模型,将其与PEI(10kD)-PBLG自组装后,分别转染真核细胞株Hela、COS-7、Vero-E6和ECV304,应用流式细胞术检测细胞转染效率,并比较了血清、缓冲液、细胞谱等多种因素对基因转染效率的影响。PEI(10kD)-PBLG可包裹质粒形成粒径100~120nm的纳米复合物,适合介导质粒进入细胞。该纳米粒复合物对转染缓冲液的敏感度较低,并能够在10%血清存在的条件下,转染全部实验用细胞株,尤其对Hela的转染效率最高,其次是COS-7、Vero-E6和ECV304;其中PEI-PBLG(10kD)/pEGFP复合物转染Hela细胞的比率为45.02%,高于PEI(10kD)/pEGFP的29.16%;PEI(10kD)-PBLG的细胞毒性作用显著低于PEI(25kD)、PEI(10kD)和PEI(25kD)-PBLG。新型阳离子多聚物PEI(10kD)-PBLG在提高PEI介导的基因转染效率的同时降低了其细胞毒性,提高了生物相容性,有望成为基因转移的有效载体。     

磁性纳米颗粒作为基因转染载体的研究

通过扫描电子显微镜和Zeta电位仪对磁性纳米颗粒的形貌、粒径、表面电位等进行了表征。利用凝胶电泳阻滞试验分析磁性纳米颗粒与DNA的结合情况,研究磁性纳米颗粒对DNA的保护效果,运用MTT和流式细胞术分析磁性纳米颗粒对细胞的毒性。以绿色荧光蛋白基因为报告基因进行293T细胞的转染,研究磁性纳米颗粒与质粒DNA不同比例条件下对293T细胞的转染效率,并与脂质体(Lipofectamine2000)介导的转染进行比较分析。结果表明,磁性纳米颗粒与DNA可以稳定结合,可以保护DNA免受酶的消化作用,当磁性纳米颗粒与DNA比为1 1时,转染效率最高,优于脂质体(Lipotamine2000)介导的转染,且对细胞的毒害作用小于Lipotamine2000。     

聚乙烯亚胺转基因影响因素的测定及其优化

聚乙烯亚胺 (PEI)为阳离子多聚物 ,可浓缩DNA形成纳米级颗粒 ,作为基因释放载体转染真核细胞 .选用Mr2 5 0 0 0 ,分枝状的聚乙烯亚胺转染质粒 ,比较多种转基因效率的影响因素 .通过MTT法测定PEI对COS 7细胞的细胞毒性 .利用电泳阻滞实验测定PEI与DNA形成复合物时所需的比例 .通过PEI转染增强型绿色荧光蛋白的pEGFP质粒、编码β 半乳糖苷酶的pSVβ质粒 ,探索氯喹、白蛋白、血清、盐离子浓度、质粒剂量、细胞数量等对聚乙烯亚胺转基因效率的影响 .实验发现 ,PEI对细胞的毒性作用与剂量相关 .PEI DNA的N P比在 3 0以上方可完全结合DNA .溶酶体抑制剂氯喹可增加转染效率 .培养液中的白蛋白、血清会降低转染效率 .生理盐溶液作为配制PEI DNA复合物的溶媒 ,转染效率高于 5 %葡萄糖作为溶媒 .随着转染质粒剂量的增加 ,转染效率呈剂量依赖正效应 .聚乙烯亚胺是有效的体外真核细胞转染剂 ,可用于合成更复杂的基因释放载体 .     

Survivin反义寡核苷酸诱导SW620细胞凋亡过程中对caspase-3表达的影响

目的：观察survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人结肠癌细胞株SW620增殖、凋亡的影响,并初步探讨其分子机制。方法：靶向survivin基因中与caspase-3结合的部位设计、合成反义寡核苷酸并通过脂质体将其转染至人结肠癌细胞SW620中。噻唑蓝（MTT）法观察survivinASODN对SW620细胞增殖的抑制作用,测定IC50;转染36h后,Hoechst33342染色荧光显微镜下观察检测SW620细胞核变化,RT-PCR检测survivinASODN处理后SW620细胞中caspase-3mRNA表达,分光光度法检测caspase-3酶活性．结果：转染8h后,SW620细胞中可见黄绿色荧光均匀分布：不同浓度survivinASODN处理SW620细胞44h后,SW620细胞增殖显著受到抑制,IC50为1×10^-6M。2×10^-7,4×10^-7,6×10^-7,8×10^-7 and1.2×10^-6M的survivinASODN处理后,细胞生长抑制率分别为15．38±0．022％、2404±0．023％、30．87±0．027％、45．02±0．018％和65．01±0．024％：Hoechest33342染色后荧光显微镜下可观察到染色质凝集并出现凋亡小体,RT-PCR检测到caspase-3mRNA表达上调,另外caspase-3酶活性显著升高。结论靶向survivin基因中与caspase-3结合的部位设计合成的survivinASODN可抑制显著结肠癌SW620增殖、诱导细胞凋亡,其机制与诱导caspase-3表达,提高caspase-3酶活性有关。     

分枝PEI 修饰的PLGA 纳米粒转染DNA 的研究*

目的:建立基于聚(乳酸-羟基乙酸)纳米粒(PLGA)载DNA的基因转染体系,比较用空白聚(乳酸-羟基乙酸)纳米粒(PLG-A-E)吸附质粒DNA和用分枝PEI修饰后的PLGA纳米粒(PLGA-BPEI)吸附质粒DNA优缺点。方法:用乳化蒸发法制备纳米粒,对纳米粒进行表征研究,包括包封率、Zeta电位、粒径大小、稳定性,用荧光显微镜观察它们对NIH3T3和HEK293细胞的转染效率,用MTT检测对它们细胞的毒性。结果:制备了两种基于PLGA的纳米粒,PLGA-E和PLGA-BPEI粒径大小为200-270nm,zeta电位为0-30mV,在血清和不同的pH值时两者均较稳定,转染效率PLGA-BPEI较PLGA-E高,且释放时间早,但前者较后者对细胞毒性大。结论:这两种基于PLGA纳米粒均能有效转染质粒DNA,它们存在不同的优缺点,应根据不同需要进行选择。     

蔗糖脂肪酸酯型阳离子脂质体的制备及基因转运性能研究

该文采用蔗糖脂肪酸酯(sucrose fatty acid esters,SEs)作为助脂质与季铵盐型阳离子脂质1,2-双-[N-十四烷氧酰胺乙基-N,N-二甲基碘化铵](CTA14)制备阳离子脂质体,测定了脂质体的粒径及Zeta电位,脂质体的平均粒径为210~230 nm,Zeta电位为50~65 mV。DNA延滞实验表明,蔗糖脂肪酸酯型脂质体能够有效压缩DNA。阳离子脂质体与绿色荧光蛋白基因(plasmid green fluorescent protein-N2,p GFP-N2)结合,形成脂质体/DNA复合物,通过载入人喉癌细胞(Hep-2)和人宫颈癌细胞(Hela),观察其转染效率和细胞毒性。结果表明,阳离子脂质与SEs以质量比1:1、2:1混合制备的脂质体均能高效转染Hep-2和Hela细胞。毒性实验显示,SEs对两种细胞的毒性很小,阳离子脂质单独存在时对癌细胞具有一定的细胞毒性,随着SEs加入量的增加,脂质体对的细胞毒性也明显减小。该文进一步证实了SEs能够作为助脂质用于基因载体系统进行基因转运。     

HA纳米载体介导转hGM-CSF基因的HepG2疫苗诱导的 抗瘤效应研究

目的:观察HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因的HepG2细胞疫苗体外抗肿瘤效应,为hGM-CSF基因修饰的HepG2细胞疫苗的临床应用提供依据。方法:HA纳米颗粒载体介导hGM-CSF基因转染HepG2细胞制备转GMCSF基因的HepG2细胞疫苗。密度梯度离心法分离人PBMC,体外诱导人PBMC。WST-1法测定PBMC的增殖活性及对HepG2细胞的杀伤效应,流式细胞术分析CD4+和CD8+的阳性表达率,ELISA法测定INF-γ的分泌。结果:WST-1结果显示,转基因HepG2组疫苗能诱导PBMC增殖,其增殖率优于野生型疫苗(p<0.05);其诱导的PBMC对HepG2的杀伤率高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。FCM结果显示,转基因HepG2疫苗组PBMC中CD4+和CD8+阳性表达率均高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。ELISA结果显示,转基因组PBMC培养上清中IFN-γ含量为1989.76±254.21pg/ml,高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。结论:HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因能增加HepG2细胞疫苗的免疫原性,转hGM-CSF基因HepG2细胞疫苗可有效诱导PBMC增殖、分化,增加INF-γ的分泌,提高其对HepG2细胞的杀伤作用。     

HA纳米载体介导转hGM-CSF基因的HepG2疫苗诱导的抗瘤效应研究

目的：观察HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因的HepG2细胞疫苗体外抗肿瘤效应,为hGM-CSF基因修饰的HepG2细胞疫苗的临床应用提供依据。方法：HA纳米颗粒载体介导hGM-CSF基因转染HepG2细胞制备转GMCSF基因的HepG2细胞疫苗。密度梯度离心法分离人PBMC,体外诱导人PBMC。WST-1法测定PBMC的增殖活性及对HepG2细胞的杀伤效应,流式细胞术分析CD4＋和CD8＋的阳性表达率,ELISA法测定INF-γ的分泌。结果：WST-1结果显示,转基因HepG2组疫苗能诱导PBMC增殖,其增殖率优于野生型疫苗（p〈0.05）;其诱导的PBMC对HepG2的杀伤率高于各野生型疫苗组和各空白对照组（p〈0.05）。FCM结果显示,转基因HepG2疫苗组PBMC中CD4＋和CD8＋阳性表达率均高于各野生型疫苗组和各空白对照组（p〈0.05）。ELISA结果显示,转基因组PBMC培养上清中IFN-γ含量为1989.76±254.21pg/ml,高于各野生型疫苗组和各空白对照组（p〈0.05）。结论：HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因能增加HepG2细胞疫苗的免疫原性,转hGM-CSF基因HepG2细胞疫苗可有效诱导PBMC增殖、分化,增加INF-γ的分泌,提高其对HepG2细胞的杀伤作用。     

HA 纳米载体转hGM-CSF 基因的HepG2 疫苗的抗肿瘤活性研究

目的:评价HA纳米载体转hGM-CSF基因的HepG2疫苗的抗肿瘤活性。方法:SCID小鼠20只腹腔内注射健康志愿者外周血淋巴细胞(1×107/ml)1.0 ml,同时背部皮下接种人肝癌HepG2细胞(1×107ml)0.2 ml。当皮下移植瘤体积长至100 mm3时,随机分四组:Ⅰ组,60Co照射的转染GM-CSF基因的HepG2细胞组,Ⅱ组,60Co照射的HepG2细胞组,Ⅲ组,生理盐水组,Ⅳ组,接种前,每组5只。MTT法检测各组小鼠脾细胞CTL活性,ELISA法检测血清IL-4和IL-12的水平。结果:转染GM-CSF基因的HepG2疫苗组小鼠脾细胞CTL活性明显高于其余组(P<0.05);同时血清Th1类细胞因子IL-12的水平明显升高(P<0.05),而Th2类细胞因子IL-4的水平无统计学意义(P>0.05)。结论:HA纳米载体转hGM-CSF基因的HepG2疫苗可刺激机体产生特异性免疫反应。     

对硝基苯硫酚分子内嵌的星形表面增强拉曼散射金 "套娃 "纳米颗粒用于肿瘤拉曼影像的初步研究

目的:制备对硝基苯硫酚(4-Nitrobenzenethiol,4-NBT)分子内嵌的星形表面增强拉曼散射(Surface enhanced Raman Scattering,SERS)金"套娃"纳米颗粒,测定其拉曼增强效果和应用于细胞以及活体肿瘤拉曼影像的可行性。方法:以种子介导法先后制备金纳米星及星形SERS金"套娃"纳米颗粒,采用透射电镜观察其形貌,激光粒度分析仪测定其粒径及Zeta电位,拉曼光谱仪测定其拉曼光谱,考察其对A549细胞的拉曼成像效果,建立A549皮下瘤模型,考察其对活体皮下瘤的成像效果。结果:制备并优化的金纳米星粒径较小,为60.5 nm,其针尖密度较高,以此为核心制备的星形SERS金"套娃"纳米颗粒形态规整,粒径约为66.7nm,Zeta电位约为-16.6 m V,拉曼增强效果提升至其前驱体金纳米星的5.3倍,能够实现对A549细胞及A549皮下瘤的拉曼成像。结论:所制备的星形SERS金"套娃"纳米颗粒形态规整均一,拉曼增强效果较好,能实现对细胞及活体肿瘤的拉曼影像。