鼻硬结克雷白氏杆菌细胞色素b-563的研究 Ⅰ.细胞色素b-563的分离、纯化和鉴定

兼性厌气菌鼻硬结克雷白氏杆菌(klebsiella rhinoscleromatis)具有不完整呼吸链,主要含细胞色素b-563,还可能含细胞色素d。可以用冻化法直接从鼻硬结克雷白氏杆菌丙酮干粉中分离及抽提细胞色素b-563。应用硫酸铵分部沉淀、Zerolit 226阳离子树脂柱层析及DEAE纤维素柱层析可将细胞色素b-563从粗抽出液中纯化800倍以上。纯化的细胞色素b-563在琼脂糖凝胶电泳中均一。氧化型细胞色素b—563的吸收峰为420、535毫微米,还原型为430、583、563毫微米。吡啶血色素原的吸收峰为419、527、557毫微米。根据光谱特性可以说明上述细胞色素属于b 型细胞色素。     

鼻硬结克雷白氏杆菌细胞色素b-563的研究 Ⅱ.细胞色素b-563的物理、化学性质和生物活力

用正铁氰化钾-亚铁氰化钾系统,测得在pH7.0,30℃时鼻硬结克雷白氏杆菌(Klebsiellarhinoscleromatis)细胞色素b-563的氧化还原电位为+0.127伏。纯化的细胞色素b-563含铁量为0.28%,依此计算得最低分子量为20000。还原型α、β及Soret 带吸收峰的毫克分子消光系数分别为35.2、20.1和197.5mM~(-1)厘米~(-1)。细胞色素b-563能自身氧化,一氧化碳和氰化钾对细胞色素b-563的吸收光谱没有影响。细胞色素b-563在鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂存在下,能被还原辅酶Ⅰ.乳酸、甲酸及琥珀酸还原,相对还原速度依次为1.6、1.5、1.24和1.0,说明纯化细胞色素b-563具有一定的生物活力。细胞色素b-563可用盐酸-丙酮方法将辅基分离。经光谱、纸层析及重组合等试验,证明辅基为氯正铁血红素。细胞色素b-563可以酶蛋白及氯正铁血红素重组合,重组合细胞色素b-563在光谱上和原细胞色素完全相同。酶蛋白和氯正铁血红素之重组合不受对氯汞苯甲酸的抑制,说明两者可能不是通过巯基相联。重组合的细胞色素b-563仍能为鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂及乳酸在厌气下还原,说明仍具部分生物活力。     

鼻硬结克雷白氏杆菌细胞色素b-563的研究——Ⅱ.细胞色素b-563的物理、化学性质和生物活力

用正铁氰化钾-亚铁氰化钾系统,测得在pH7.0,30℃时鼻硬结克雷白氏杆菌(Klebsiella rhinoscleromatis)细胞色素b-563的氧化还原电位为+0.127伏。纯化的细胞色素b-563含铁置为0.28%,依此计算得最低分子量为20000。还原型α、β及Soret带吸收峰的毫克分子消光系数分别为35.2、20.1和197.5mM~(-1)厘米~(-1)。细胞色素b-563能自身氧化,一氧化碳和氰化钾对细胞色素b-563的吸收光谱没有影响。细胞色素b-563在鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂存在下,能被还原辅酶Ⅰ.乳酸、甲酸及琥珀酸还原,相对还原速度依次为1.6、1.5、1.24和1.0,说明纯化细胞色素b-563具有一定的生物活力。细胞色素b-563可用盐酸-丙酮方法将辅基分离。经光谱、纸层析及重组合等试验,证明辅基为氯正铁血红素。细胞色素b-563可以酶蛋白及氯正铁血红素重组合,重组合细胞色素b-563在光谱上和原细胞色素完全相同。酶蛋白和氯正铁血红素之重组合不受对氯汞苯甲酸的抑制,说明两者可能不是通过巯基相联。重组合的细胞色素b-563仍能为鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂及乳酸在厌气下还原,说明仍具部分生物活力。     

菠菜和水稻细胞色素b-559的分离纯化及其光谱性质研究

采用一种快速简捷的方法从菠菜(Spinacia oleracea L.)和水稻(Oryza sativa L.)中分离纯化了光系统Ⅱ反应中心内的细胞色素b-559,并且研究了其低温可见光区荧光光谱、室温紫外区荧光光谱、吸收光谱以及电泳特性.该方法的主要特点:1.以放氧核心复合物为起始材料以避免其他细胞色素的干扰;2.选用DEAE-Sephacel为层析介质,用等度洗脱除去杂蛋白和叶绿素;3.用同一介质不同条件去除过量的去垢剂.从两种植物中分离纯化的Cyt b-559具有相似的吸收光谱,在非变性电泳中有相同的泳动特征.用修订的适用于分析小蛋白的Tricine-SDS-PAGE证明,从两种植物中分离得到的Cyt b-559都是由两个多肽亚基组成,它们的表观分子量分别为9 kD和4 kD.低温荧光光谱的结果表明,Crt b-559的荧光激发峰位为413nm和439 nm,荧光发射峰位在563 nm和668 nm,首次证明Cyt b-559可以发出荧光并将电子传递给叶绿素.首次通过Cyt b-559的紫外荧光光谱证明Trp残基位于该蛋白的疏水跨膜区内.     

叶绿体中的细胞色素b-559

细胞色素b-559是由叶绿体基因编码α、β亚基为单位构成的一种血红素蛋白,是光系统II反应中心的重要组分。以叶绿体为实验材料的研究表明,细胞色素b-559可通过氧化还原变化调节光系统II的光抑制敏感性,并对发生在供体侧和受体侧抑制的光系统II反应中心具有保护作用,但对整体植物在生理条件下的作用却未得到证实,这也正是今后需要研究的问题。     

叶绿体中细胞色素的氧化还原光谱变化研究

通过不同的氧化还原试剂处理,可以使叶绿体中的细胞色素b-559、细胞色素f和细胞色素b6的光谱信号分别显示出来。TritonX-100处理及长时间放置可使叶绿体中的细胞色素b-559由高电位型式转变为低电位型式。解联剂的存在有助于观测细胞色素f的光氧化信号。预先加入铁氰化钾氧化的叶绿体中,可看到细胞色素b－559的光还原,这种还原被DCMU所抑制。     

棉阿舒囊霉细胞色素C的纯化、结晶和专一性的比较

棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)细胞色素C可用氯化钠抽提法或乙酸乙酯自溶法从菌体中抽出,经阳离子交换树脂Zeroli*226柱层析、硫酸铵分部沉淀及反透析后,可被纯化和结晶。乙酸乙酯自溶法的抽提得率高于氯化钠抽提法。两种方法抽提及纯化的细胞色素C在电泳中都表I见为均一,但氯化钠抽提之细胞色素C的生物活力略高于用乙酸乙酯抽提的细胞色素C。     

心磷脂引起细胞色素C的氧化

心磷脂—细胞色素C—细胞色素C氧化酶体系吸收光谱的研究发现:心磷脂与氧化态细胞色素C结合产生230nm吸收峰;心磷脂与还原态细胞色素C作用,230nm吸收值上升,550nm吸收值下降,表明心磷脂可以引起细胞色素C的氧化。     

酮古龙酸菌细胞色素c的表达、成熟及活性分析

目的:从酮古龙酸菌Y25中扩增细胞色素c基因,在大肠杆菌中表达、成熟并进行生物活性分析。方法:从酮古龙酸菌Y25基因组中PCR扩增细胞色素c基因,构建pET22b表达载体;从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增细胞色素c成熟基因簇ccmABCDEFGH,连接到带有山梨糖脱氢酶组成型启动子的pBBR1MCS2-P200载体中;将构建的2个质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行血红素染色检测;通过氧化还原光谱法对Ni柱亲和纯化的重组蛋白进行活性分析。结果:扩增得到1404 bp的细胞色素c基因及6481 bp的ccmABCDEFGH基因簇;重组菌株经IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析,可见相对分子质量为50×103的表达条带;血红素染色显示重组蛋白结合有血红素;经氧化还原光谱扫描,显示亲和层析纯化得到的目的蛋白有细胞色素c特征吸收峰。结论:从酮古龙酸菌Y25中扩增得到了细胞色素c基因,在大肠杆菌中进行了表达和成熟,表达蛋白具有细胞色素c生物活性。     

细胞色素P450的多样性

细胞色素Ｐ４５０的多样性＊邱星辉冷欣夫（中国科学院动物研究所,北京１０００８０）关键词细胞色素Ｐ４５０多样性细胞色素Ｐ４５０是一类以还原态与ＣＯ结合后在波长４５０ｎｍ处有吸收峰的含血红素的单链蛋白质［１～３］。它于１９５８年被发现以来,就引起了人们的...     

微粒体细胞色素P-450、NADPH-细胞色素P-450还原酶的纯化与重组活性

经苯巴比妥钠诱导的雄性大白鼠的肝微粒体纯化的细胞色素P-450同功酶组份,经SDS-PAGE鉴定呈电泳纯,分子量为55kD。部分纯化的NADPH-细胞色素P-450还原酶,含72和77kD两个蛋白质组分。上述细胞色素P-450和NADPH-细胞色素P-450还原酶与卵磷脂制备的脂质体重组后的活性试验表明,对艾氏剂有环氧化作用,对环已烷有羟化作用,对溴氰菊酯的羟化作用微弱。当重组系统中缺少细胞色素P-450组份时,对环已烷不再起作用。同时还研究了纯化的细胞色素P-450的光谱特性。     

紫色非硫光合细菌Rhodopseudomonas capsulata细胞色素c_3的纯化及理化特性的研究

菌体经超声破碎,高速离心,二次DEAE-52柱层析和Sephadex G-100分离纯化,得到凝胶电泳纯的细胞色素c_3。特征吸收峰在氧化态时为405,525nm;还原态时为417,520,545nm。用Sephadex G-100凝胶过滤,SDS凝胶电泳方法,测得分子量分别为12,500,13,000D。氨基酸组份分析表明最低分子量为13,500D左右。恒电位电量法测其中点电位为-364mV,参与氧化还原作用时,传递电子数目为2。氧化态时在g值为2.581,2.203,1.715处有特征的ESR波谱,还原态时,ESR波谱消失。     

高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b5还原酶I的克隆、表达和功能鉴定

【目的】鉴定产油微生物高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ的功能。【方法】将高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因与人可溶性细胞色素b_5还原酶基因序列比对,去除该基因N端穿膜区域后,与人可溶性细胞色素b_5基因分别在大肠杆菌中异源表达;通过钴离子亲和层析、离子交换和分子排阻色谱等方法对表达产物进行纯化;以2,6-二氯靛酚钠(DCIP)为底物,测定细胞色素b_5还原酶Ⅰ的体外活性及其对NADH和NADPH的偏好性;在反应体系中存在NADH时,通过全波长扫描方法检测细胞色素b_5还原酶Ⅰ与细胞色素b_5的相互作用。【结果】高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ被成功可溶表达,经纯化后检测到体外活性:使用NADH时酶活为564.57 U,使用NADPH时为51.97 U;在NADH存在时,细胞色素b_5还原酶Ⅰ能够还原细胞色素b_5,其吸收峰从411 nm偏移至422 nm,并在521 nm和554 nm处吸光值增加。【结论】细胞色素b_5还原酶Ⅰ N端穿膜区域的去除增加了其可溶性,并保持了蛋白质活性;高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因编码的是一种NADH-细胞色素b_5还原酶,其在体外能与细胞色素b_5相互作用。     

细胞色素C和含心磷脂的人工脂膜相互作用

 本文报告以芘为荧光探剂,研究细胞色素C和含心磷脂的人工脂膜的相互作用。1.由于芘和细胞色素C的血红素团之间的能量转移,细胞色素C与心磷脂结合引起芘的单体荧光发射峰(395nm)强度下降。这种淬灭效应受脂膜的相行为影响,在液晶相时淬灭效应小于凝胶相;2.氧化态细胞色素C与还原态相比,对心磷脂结合的视和度稍高;3.在以芘的激发二聚体荧光峰(475nm)强度与单体荧光峰强度之比做为脂膜流动性的指标,发现还原态细胞色素C与含心磷脂脂膜结合后引起流动性增加的效应高于氧化态的结合。     

细胞色素f在光合膜上功能的初步探讨

用阳离子一竭尽的菠菜叶绿体膜作为实验材料,比较研究了胰蛋白酶消化的叶绿体膜和非消化的叶绿体膜的四阶导数吸收光谱、细胞色素f的还原减氧化差异光谱和电子传递速率的变化,试图探索细胞色素f在光合膜上的功能.主要结果于下:(1)胰蛋白酶消化引起叶绿体膜四阶导数吸收光谱位于554nm吸收峰(CYT.f的特征吸收峰)下降和细胞色素含量的明显减少.说明胰蛋白酶损伤细胞色素f.(2)胰蛋白酶消化对叶绿体膜从DCIPH_2到甲基紫精的非循环式电子传递速率没有影响,而对PMS存在下的甲基紫精光还原速率有明显的刺激作用.说明胰蛋白酶损伤与循环式电子流有关的细胞色素f.根据试验结果的分析.我们推测,在光合膜上可能存在两种类型的细胞色素f.一种可能与循环式电子流有关.另一种可能与非循环式电子流有关.     

2-十三烷酮对棉铃虫细胞色素P450的诱导作用

将2-十三烷酮按0.005%～0.01%（重量比）的浓度加到棉铃虫人工饲料中,连续诱导3代,测定棉铃虫中肠和脂肪体中细胞色素P450(cyt-P450)含量以及与标准配基（正丁醇、吡啶、苯胺、环己烷）形成的氧化型结合光谱。2-十三烷酮诱导品系的中肠cyt-P450与CO结合光谱的最大吸收峰在449 nm处,脂肪体cyt-P450与CO结合光谱的最大吸收峰在450.7 nm处。中肠cyt-P450除了在450 nm附近存在一个吸收峰外,在通入CO后依次在414、415、418 nm附近出现吸收峰,随后该峰消失,随着时间的推移（第31次扫描）在420 nm处又开始出现一个弱吸收峰。2-十三烷酮诱导品系的中肠、脂肪体cyt-P450与4种标准配基形成的差光谱与对照相比在峰型上存在着不同程度的差异。中肠cyt-P450与正丁醇形成双峰双谷的光谱;脂肪体cyt-P450与正丁醇形成的光谱最大吸收峰在416.61 nm处,波谷在424.91 nm处;中肠cyt-P450和脂肪体cyt-P450与吡啶形成的光谱为典型的Ⅱ型光谱,而与环己烷形成的光谱为不典型Ⅰ型光谱;中肠和脂肪体的cyt-P450与苯胺形成典型的Ⅱ型光谱,最大吸收峰分别在443.30和428.92 nm处,最小吸收分别在402.30和401.00 nm处。     

MiR-18b-5p对人滋养细胞系HTR-8细胞迁移功能的影响

目的:通过研究子痫前期胎盘组织中低表达的miR-18b-5p(微小RNA18b-5p)对人滋养细胞系HTR-8迁移能力的影响,进一步探讨miR-18b-5p在子痫前期发病过程中的作用。方法:将化学合成的miR-18b-5p inhibitor、miR-18b-5p inhibitor NC,采用瞬时转染的方法将miR-18b-5p inhibitor转入人滋养细胞系HTR-8中设为实验组;miR-18b-5p inhibitor NC转入HTR-8细胞中设为阴性对照组;空白转染组为空白对照组。应用Realtime RT-PCR技术检测各组miR-18b-5p在mRNA水平的表达,同时采用微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统(Transwell实验)检测实验组与对照组细胞迁移能力的变化。结果:Realtime RT-PCR结果显示:转染miR-18b-5p inhibitor后miR-18b-5p的表达量分别与阴性对照组和空白对照组相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。Transwell实验结果显示miR-18b-5p inhibitor组与两对照组相比细胞的迁移能力明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:在HTR-8细胞中降调节miR-18b-5p可以显著的降低细胞的迁移能力,推测病理性低表达的miR-18b-5p有可能通过降低滋养细胞的迁移能力,使妊娠早期细胞滋养细胞从固体绒毛顶端迁出减少,导致覆盖合体滋养细胞进而形成具有增殖能力的细胞簇减少,最终造成滋养层浅表植入,从而引起子痫前期的发生。     

miR-199b-3p通过靶向PLCε抑制前列腺癌细胞的恶性增殖

该研究的目的是确定miR-199b-3p在前列腺癌(PCa)中的表达及其对PCa细胞增殖的影响及作用机制。通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-199b-3p在PCa组织、良性前列腺增生(BPH)组织、PCa细胞及人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)中的表达,并分析其表达与PCa临床病理特征的关系。蛋白质印迹法(Western blot)用于检测磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C epsilon(PLCε)的表达。采用CCK-8法和克隆形成实验对其体外增殖进行评估。Edu测定法用于检测细胞对Edu的吸收。荧光素酶报告实验被用来验证miR-199b-3p和PLCε的靶向结合情况。结果显示,在PCa组织中miR-199b-3p的表达水平明显低于BPH组织,且与临床病理特征中的组织学分期相关。上调miR-199b-3p可以显著抑制PCa细胞的增殖和Edu的摄取能力,PLCε被鉴定为miR-199b-3p的下游靶基因,且其表达量与miR-199b-3p的表达量呈负相关。此外,补救实验结果显示,上调PLCε能够逆转miR-199b-3p在PCa细胞增殖中的抑制作用。总之,miR-199b-3p可通过靶向PLCε 3?非编码区(3?-UTR)负性调控PLCε进而抑制PCa细胞的恶性增殖。     

去血红素细胞色素c的制备及其结构研究

在酸性条件下用硫酸银断裂马心细胞色素ｃ（以下简称ｃｙｔ．ｃ）的肽链与血红素相连的硫醚键,通过酸性丙酮抽提,巯基乙醇处理及超速离心等步骤纯化得去血红素的ｃｙｔ．ｃ（以下简称Ａｐｏ－ｃｙｔ．ｃ．）．Ａｐｏ－ｃｙｔ．ｃ与天然ｃｙｔ．ｃ相比,其酸性电泳迁移率明显降低,紫外－可见光谱在１９０￣２２０ｎｍ处吸收上升,荧光光谱的最大发射峰波长产生红移,同时ＣＤ谱中ａ螺旋的特征峰完全消失,这说明在ｃｙｔ．ｃ去血红     

磷对悬浮培养的西红花细胞生长和色素合成的影响

研究了磷对悬浮培养的西红花细胞生长、色素合成和主要营养物质吸收利用的影响。结果表明:不同初始磷浓度(低磷0.272 mmol/L、中磷0.544 mmol/L、高磷0.816 mmol/L)下西红花细胞均经历延滞期(0~3 d)、快速生长期(低、中磷3~15 d,高磷3~12 d)、稳定期(低、中磷15~21 d,高磷12~18 d)和衰亡期(低、中磷21~39 d,高磷18~39 d)这4个阶段,生长曲线呈S形。培养过程中比生长率呈下降趋势,磷对比生长率有一定影响。培养前9 d高磷下比生长率最高,中磷次之,9 d后高磷下的比生长率快速下降,中磷最高。进入快速生长期色素开始合成,到衰亡期色素仍继续合成,并且色素含量达到最高,随后色素开始降解,含量下降,色素合成期比细胞生长期长。因此,西红花细胞培养过程中色素合成与细胞生长不完全同步,属于部分耦联型。培养过程中色素比合成率呈上升趋势,磷对色素比合成率有一定影响。中磷浓度下色素比合成率最高。在快速生长期前期(6 d)质量分数95%蔗糖被降解为葡萄糖和果糖而被细胞吸收利用,培养18 d时质量分数85%葡萄糖被吸收利用,21 d时质量分数85%果糖被细胞吸收利用。培养3 d时胞外摩尔分数95%NH+4被细胞迅速吸收利用,而NO-3吸收利用较为缓慢,21 d时摩尔分数80%NO-3被吸收利用。提高初始磷浓度,果糖和NO-3的吸收利用速率亦随之提高,同时发现提高NO-3的吸收利用速率是提高色素合成能力的关键,高磷条件下细胞对NO-3的吸收利用速率显著提高。稳定期后期80%以上的营养物质被吸收利用,碳、氮源的不足影响了细胞生长,但对色素合成影响不大。