提高大肠杆菌表达外源蛋白胞外含量的策略

大肠杆菌的蛋白质表达平台在工业和农业中得到了广泛应用,使目的蛋白质表达后释放至胞外更有利于大规模的生产。目前,已经研究出许多改善外源蛋白胞外含量的方法。本文从蛋白质分泌机制、菌株、信号肽、载体和培养条件的选择和优化改造、密码子的优化和蛋白质跨膜转运过程的改善等方面总结了提高大肠杆菌表达外源蛋白的胞外含量的各种策略,指出多因素协同作用才能更全面地提升蛋白质的胞外产量。     

新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达

大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白基因表达系统。因其遗传背景清楚,容易培养,能大规模发酵,并有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体,而成为人们克隆和表达外源基因的首选菌株。但是,许多外源蛋白基因在大肠杆菌胞内表达时,往往不能自发折叠卷曲生成有一定空间结构和特定生物功能的蛋白质,而是以一种不溶性的沉淀即包涵体的形式     

外源基因在大肠杆菌中的高效表达

为了提高外源蛋白在大杨杆菌中的表达量,人们对大肠杆菌表达系统进行了许多研究。作者综述了有关外源基因在大肠杆菌中高效表达的研究进展。     

融合表达载体的研究进展

基因工程的实施,主要包括DNA克隆、外源基因的表达及其重组产物的纯化。基因表达是指一个外源基因在表达系统中,既能高效表达又具有原来的生物学活性。目前有三个表达系统,即大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞。其中大肠杆菌最早研究应用,但表达质粒转人受体菌（宿主）后,并不都能获得理想的结果,它涉及到许多因素：诸如基因结构的特点、mRNA的转录效率、蛋白质的折叠、宿生蛋白酶对重组产物的水解作用、外源基因和E·COlt基因间所存在的差异以及表达产物对宿主细胞的毒性等;此外,在高效表达的同时,为了更好地获得人们所需要的重…     

大肠杆菌高效表达包函体蛋白N－Met的加工

大肠杆菌高效表达包函体蛋白Ｎ－Ｍｅｔ的加工杨新颖,梁镇和,李伯良（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词牛生长激素;高效表达;Ｎ－Ｍｅｔ氨肽酶基因工程已使许多外源基因或基因片段在大肠杆菌中实现了高效表达,最高的表达蛋白质带可达全菌总蛋白质...     

大肠杆菌中外源基因表达的研究进展

工程技术已使许多生物活性蛋白基因在大肠杆菌中中得到表达,但不同外基因表达效率并异很大,本文综述了影响外源基因表达的一些因素,以便采取有效方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率。     

大肠杆菌系统中外源蛋白分泌的研究

要使基因工程产物达到工业化生产的规模,不仅要解决基因的高表达,还需要解决产物的分泌问题。 大肠杆菌系统中外源蛋白分泌的主要障碍是外膜,从遗传和生化两方面研究入手,通过定点突变、基因融合、构建分泌型载体等方法将可能阐明分泌的机制并找到有效的应用途径。     

大肠杆菌中的蛋白质分泌

目前,在微生物遗传工程中应用的表达载体大多是指导目的基因在宿主的胞质中表达,尽管外源蛋白的产量可达菌体总蛋白的50％以上,但同时也存在不少缺点:(1)高水平表达的外源蛋白容易发生沉降、凝聚,难以重新折叠为正确构象,不易获得有功能的产品;(2)产品纯化工艺复杂;(3)对宿主有毒性作用,导致表达体系不稳定;(4)外源蛋白易被胞内蛋白酶降解。这使得微生物遗传工程的应用受到很大限制。 如果能使在胞质表达的外源蛋白分泌到胞外,既可纠正由子高表达所引起的种种不利。近十年开展了对E.coli中蛋白质定位的深入研究。E.coli的蛋白质最初都是在胞质合成的,通过分泌而定位于膜或周质。例如外膜蛋白A(OmpA)先以前体形式在胞质合成,然后借助信号肽的作用穿过内膜,在分泌过程中信号肽被切除成的成熟蛋白定位子外膜。现在许多作者利用E.coli分泌蛋白的信号肽序列与目的基因相融合,将外源蛋白分泌出胞质。如用碱性磷酸酶(phoA)的信号肽分泌人α干扰素,使产物的稳定性和产量都有所提高,并且可通过简单的物理技术得到产品。E.coli溶血素通过特殊的分泌机制穿越细胞膜分泌至培养基,现已尝试用该系统构建表达载体。 本文从信号肽的作用、成熟蛋白对分泌的影响、宿主在分泌中的作用、E.coli溶血素的分泌以及外源蛋白在E.coli中的分泌等几方面综述近几年研究E.coli蛋白质分泌的进展。     

乳腺生物反应器的表达优化策略

乳腺生物反应器是指将外源基因导入动物基因组并在动物乳腺中特异性表达,利用动物乳腺合成、分泌蛋白的功能,在其乳汁中获得外源蛋白的技术。乳腺生物反应器凭借其高表达、低成本以及合成蛋白质的结构接近天然蛋白质等优势而被视为药用和营养蛋白生产的一次技术革新,然而由于外源基因随机整合以及重组蛋白表达不稳定等问题极大地限制了其应用。本文结合乳腺生物反应器的发展现状,从利用基因编辑技术、筛选合适的外源基因整合位点以及改进外源基因调控序列3个方面对乳腺生物反应器优化策略进行了综述,以期为提高乳腺生物反应器生产重组蛋白的表达提供理论借鉴。     

信号肽序列及其在蛋白质表达中的应用

信号肽在蛋白分泌的过程中起重要作用,分泌性蛋白质合成后由信号肽引导其穿过合成所在的细胞到其他组织细胞中。可以利用因特网在线工具和信号序列捕获系统来判定基因序列中是否含有信号肽序列。外源蛋白的表达形式多为细胞内不溶性表达(包涵体),少数为细胞外分泌表达。利用信号肽来引导外源蛋白分泌可避免因包涵体复性带来的困难。研究表明,多种外源基因连接上信号肽后在原核表达系统如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌中等都得到了分泌表达;信号肽也广泛应用于真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统,以提高蛋白的表达量。     

一种含ELP60基因的载体pRELPN促进大肠杆菌的外源基因的高表达

类弹性蛋白多肽（ELP）为含有人工合成的ELP60基因的表达载体pRELPN,能促使外源基因在大肠杆菌中的高表达。当ELP60在大肠杆菌表达载体pET28a的多克隆位点被克隆后,其自身的表达低,也不与目的基因构成ELP融合蛋白质,而是促进克隆在ELP60基因后的含起始密码ATG的外源目的基因独立高表达。外源目的基因表达量占宿主蛋白的20% ～ 60%,比用pET28a载体表达的外源基因表达量高2～10倍。此类表达载体pRELPN适合于表达包括抗体、抗原、酶、重组蛋白质、多肽及ELP融合蛋白质等的外源基因的独立高表达。这些结果表明,pRELPN代表了一种有效的表达载体,有助于解决在原核表达中,所受限的普通载体对外源基因低表达或不表达所导致的不能产业化的问题。     

未来水稻遗传工程中的有利抗性基因

从技术上来讲,水稻基因工程是可行的,目前嵌合基因结构体能被整合至水稻细胞的核DNA中,具有原基因的重组细胞可再分化出植株;外源基因变成了水稻基因组的一个组分,它们可在再生植株上表达开遗传至下一代。外源基因整合位点一般是随机的,它可编码一种新蛋白或改变原受体细胞蛋白质的合成水平及位置。不过将外源基因命中至水稻基因组中的特定位点或借助工程法代替一个原有基因的技术还未达实用水平。未来的工作是增进现有转化技术的可靠性和有效性或扩大技术应用的品种范围,目前许多研究正集中在鉴定可导入水稻并表现出新的有利农艺、营养和商品价值性状的基因结构。     

几种基因随机突变方法在"外源基因全序列结构优化"表达研究中的效率比较

“外源基因全序列结构优化”是依据外源基因序列结构是影响其在大肠杆菌中表达的重要因素,而提出的一种新的实现外源基因在大肠杆菌中高效表达的策略。该策略包括以下几个步骤:1目的基因全序列变异文库的构建;2利用高通量表达筛选载体从变异文库中筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。其中,变异文库的构建方法和性质对研究的结果有着重要的影响。变异文库的构建可有多种方法,其中低频率的随机突变方法是一重要的类型。为了探索最适合突变的方法,我们以HIV-1gp120-801基因为模型、选用了一组基于PCR技术的基因随机突变技术用来构…     

受溶氧浓度调控的新型大肠杆菌表达系统

利用透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因在大肠杆菌中的转录过程受环境溶氧浓度调控,在贫氧条件下基因转录被激活的性质,构建了一个在贫氧条件下能高效表达外源基因的新型大肠杆菌表达系统。该表达系统包括一个古血红蛋白基因启动子元件控制T7RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒的宿主菌GJ100和另一个T7启动子控制外源基因表达的质粒载体。研究结果表明大肠杆菌本身的硫氧还蛋白,原核生物的金黄色葡萄球菌A蛋白IgG结合区(ZZ),真核生物的蛇神经毒素融合蛋白,鲑鱼降钙素六聚体,人白细胞介素Ⅱ和人尿激酶原等基因均能在该系统中获得高效表达。重组蛋白表达的水平可达细胞总蛋白的30％以上。     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置:胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和用途 。     

重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略

大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素,并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤,总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。     

噬菌体展示技术及其在寄生虫研究中的应用

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的编码基因或DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达,并随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术.在研究蛋白质识别或蛋白质与核酸相互作用的生物学过程、蛋白质定向改造、研制新型多肽药物、疫苗和抗体等多领域具有重要作用.就噬菌体展示技术基本原理及特点,以及噬菌体展示技术在寄生虫研究中的应用做一简要综述.     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置：胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和途径。     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统 ,与传统的大肠杆菌和酿酒酵母表达体系相比 ,其具有的诸多优势使之研究价值及应用价值不断体现。综述了其在生物学特性、表达载体、基因整合、外源蛋白的分泌、诱导表达及发酵等方面的基础研究及新近研究进展。     

改良毕赤酵母分泌表达外源蛋白能力的研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)由于能高效表达正确折叠加工的外源蛋白而成为目前最具应用前景的表达宿主.但随着对大量不同外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究发现,并不是所有蛋白均能高效分泌表达,这严重限制了毕赤酵母这一表达系统的推广应用.相关研究发现,外源蛋白在内质网中的聚集是限制酵母分泌表达外源蛋白的主要因素,因此近年来开始尝试通过基因操作改良毕赤酵母表达外源蛋白的能 力.本文综述了这一领域的研究进展.