柱孢鱼腥藻的铁蛋白与棕色固氮菌的钼铁蛋白的交叉互补作用

纯化的柱孢鱼腥藻铁蛋白能够与棕色固氮菌的钼铁蛋白有效地交叉反应,展现较高的活性。此异源交叉反应的乙炔还原比活及放氢比活,分别是蓝藻同源互补比活的83.8及66．7％。比较藻铁蛋白与菌钼铁蛋白异源交叉反应及藻固氮酶组分之间的同源反应的动力学特点时发现,铁蛋白对钼铁蛋白的最佳克分子比数前者(异源交叉反应)较后者(藻同源反应)为高,前者为5,后者为1;但反应的时间进程两者差别不大。     

棕色固氮菌钼铁蛋白结晶及一些物理化学性质

获得了棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的针状结晶,大小为2-2.5×25-65微米,成晶所要求的条件不是很严格的。SDS 电泳和氨基酸分析结果表明,钼铁蛋白分子量为250,000。只观察到一种类型亚单位。其中酸性氨基酸占优势。分子氧使针状晶体演变为发状晶丝,晶丝又密集成束。晶束可保存较长时间。氧使钼铁蛋白在电泳时形成高聚合态。       

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白两种聚合体的研究

 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白八聚体相当于两个钼铁蛋白四聚体的聚合体。在细胞生长过程中,胞内钼铁蛋白两种聚合体的相对含量出现规律性变化:在对数期,细胞固氮酶比活力成上升趋势,而钼铁蛋白主要以高活力的四聚体形式存在;在对数期结束至稳定期,细胞固氮酶比活力下降至一个低水平的稳定值,此时的钼铁蛋白基本上为八聚体形态。在细胞固氮生长时,向培养基中加入过量氨可明显地导致钼铁蛋白由四聚体向八聚体的转化。我们推断,生长过程中胞内钼铁蛋白聚合态的变化可能是调节固氮酶活力的一种方式。胞外,钼铁蛋白的两种聚合态可以相互转化。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的几种化学修饰方法

用对氯汞苯甲酸或二巯基双二硝基苯甲酸修饰巯基。用三硝基苯磺酸、重氮四唑和焦碳酸二乙酯分别修饰氨基、酚式羟基和眯唑基。在一定范围内,被修饰钼铁蛋白在特征波长吸收值的上升和重组活性的下降与修饰剂用量的增加和时间的延长相一致,超过该范围后则光吸收和活性都保持不变。由于无氧凝胶过滤去除多余的修饰剂时未加连二亚硫酸钠,甚至正常钼铁蛋白的重组活性下降了24.2％,修饰后的铝铁蛋白活性下降范围为23.4～41.4％不等。     

棕色固氮菌钼铁蛋白的金属原子簇与其构象的关系

棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）固氮酶钼铁蛋白的紫外ＣＤ谱在２０５—２３５ ｎｍ 出现由峰位分别为２０８ 和２２２ ｎｍ 的双负峰组成的负槽;经邻菲口罗啉在厌氧或有氧环境中处理后,在２２２ ｎｍ 的负峰随该蛋白中Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ 和ＦｅＭｏｃｏ 含量的降低而减少。在分别由Ｎａ２ＭｏＯ４、Ｎａ２Ｓ、二硫苏糖醇和高柠檬酸铁或柠檬酸铁组成的重组液重组后,上述两种处理蛋白在２２２ ｎｍ 的负峰又随其Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ和ＦｅＭｏｃｏ含量的恢复而恢复。表明,钼铁蛋白的金属原子簇与蛋白质构象间存在明显的相关性     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白纯净铁钼辅因子的制备和性质

建立了以挥发性酸碱(TFA/NH_4OH)和NH_4OH碱化的NMF从棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白分离提取纯净铁钼辅因子(FeMo—co)的方法。得到了纯净FeMo-co的NMF制剂,从而证明了Tris、ClNa~ 、柠檬酸、HPO_4~(-2)、S_2O_4~(2-)以及氨基酸残基不为FeMo—co的有效分离和结构稳定所必需。制备的纯净FeMo—co的Fe/Mo比为8,比活为230nMC_2H_4/min/MoMn。由于分离制备的FeMo—co制剂除抽提溶剂NMF外不含任何其他成分,所以是进行FeMo—co结晶和结构研究的理想材料。     

H2O2对棕色固氮菌钼铁蛋白的损伤

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经Ｈ２Ｏ２作用后,钼铁蛋白的Ｍｏ和Ｆｅ原子含量,乙炔还原少在性,摩尔消光系数和α－螺旋度地匀显著降低,蛋白质肽链也许发生部分断一。本和纱中存在过氧化物酶。可避免Ｈ２Ｏ２对钼铁蛋白的损伤作用,表明Ｈ２Ｏ２对钼欠蛋白的金属原子簇和蛋白质结构均有明显的损伤作用,而过氧化物酶可保护固氮酶不受Ｈ２Ｏ２的破坏。     

PEG和盐对棕色固氮菌细菌铁蛋白和钼铁蛋白晶体生长的影响

棕色固氮菌（ＯＰ）体内的固氮酶钼铁（ＭｏＦｅ）蛋白和细菌铁蛋白均为重要的生物功能蛋白。前者为生物固氮的关键酶［１］,后者则可为生物代谢贮存丰富而又可溶的铁原子［２］。因而都得到了广泛而深入的研究。Ｋｉｍ［３］报道了ＭｏＦｅ蛋白衍射结果。赵宝光等［２］...     

棕色固氮菌nifZ与固氮酶钼铁蛋白P—cluster合成的关系

与野生型固氮菌（OP）MoFe蛋白相比,缺失nifZ的棕色固氮菌（AzotobactervinelandiiLipann）突变种的△nifZMoFe蛋白对乙炔的还原活性和Fe／Mo比值都显著降低。在相同实验条件下从这两种MoFe蛋白中抽提出的FeMoco在催化活性和金属组成方面都很相似,而这两种蛋白的圆二色（CD）谱则有显著差异,除在540－750nm外,△nifZMoFe蛋白在可见光区域380－540nm的△ε明显降低并在430nm附近处出现一个奇特的尖负峰;而在紫外区域的208nm和222nm负峰的高度却明显增加。△nifZMoFe蛋白可在合适浓度的PEG8000和MgCl2溶液中结晶出来,而晶体大小和出现沉淀多少与上述CD谱的负峰有关。这表明：棕色固氮菌nifZ与MoFe蛋白P-cluster的合成有关,并由此影响蛋白质的构象、稳定性和结晶过程。     

缺失nifH的棕色固氮菌突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养的缺失nifH的棕色固氮菌(AzotobactervinelandiiLipmann)突变种DJ54中,分离纯化出部分纯的缺失FeMoco的钼铁蛋白(ΔnifHAv1)。用相同纯化方法分别从DJ35和UW45突变种中纯化的ΔnifEAv1和NifB-Av1的纯度明显高于ΔnifHAv1的纯度。在合适的结晶条件下,可得到这三种蛋白的深棕色短斜四棱柱晶体。ΔnifHAv1与NifB-Av1一样,晶体形成所需的时间比ΔnifEAv1的长。而它结晶所需的沉淀剂和缓冲液最适浓度则与ΔnifEAv1的相同。SDS-PAGE鉴定表明,结晶的ΔnifHAv1与OPAv1的组成相似。这表明,在ΔnifHAv1溶液中形成的晶体可能就是该蛋白质的晶体。     

缺失nifH的棕色固氮菌突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养的缺失nif H的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ54中,分离纯化出部分纯的缺失FeMoco的钼铁蛋白(△nifH Av1).用相同纯化方法分别从DJ35和UW45突变种中纯化的△nifE Av1和NifB- Av1的纯度明显高于△nifH Av1的纯度.在合适的结晶条件下,可得到这三种蛋白的深棕色短斜四棱柱晶体.△nifH Av1与NifB- Av1一样,晶体形成所需的时间比△nifE Av1的长.而它结晶所需的沉淀剂和缓冲液最适浓度则与△nifE Av1的相同.SDS-PAGE鉴定表明,结晶的△nifH Av1与OP Av1的组成相似.这表明,在△nifH Av1溶液中形成的晶体可能就是该蛋白质的晶体.     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白中含钼铁活性小分子组分的解离

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白结晶,经酒石酸解离后得到一个含钢铁小分子组分,与棕色固氮菌突变株uw_(45)无细胞提取液的重组比活为6.8nM Mo natom~(-1) min~(-1)。它是由二种物质组成的混合物,其分子量分别为2100和1850道尔顿,分子量为2100道尔顿的成分含钼铁。酒石酸处理后的沉淀,再用N—甲基甲酰胺抽提得到的含钼铁组分具有恢复突变株uw_(45)乙炔还原活性的能力。经纸层析鉴定与用Shah法制备的铁钼辅因子相类似。由于Shah和Smith法制备的两种铁钼辅因子还原乙炔和氰化钾的比活不同,而且分子量也有大小,说明这两种铁钼辅因子结构可能不尽相同。     

棕色固氮菌缺失nifE的突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)缺失nifE的突变种DJ35中,分离纯化得到缺失FeMoco的钼铁蛋白(ΔnifE Av1).在一定条件下结晶得到深棕色短斜四棱柱晶体.结晶溶液中各组分的浓度以及结晶方法等对其晶核数目、晶体大小和质量有明显影响.目前用气相扩散的悬滴法所得的最大晶体的二维边长分别为0.12 mm和0.13 mm.     

棕色固氮菌缺失nifE的突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii Lipmann)缺失nifE的突变种DJ35中,分离纯化得到缺失FeMoco的钼铁蛋白（△nifEAvl)。在一定条件下结晶得到深棕色短斜四棱柱晶体。结晶溶液中各组分的浓度以及结晶方法等对其晶核数目,晶体大小和质量有明显影响,目前用气相扩散的悬滴法所得的最大晶体的二维边长分别为0.12mm和0.13mm。