核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的酶学性质

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）是AROM多功能酶的活性之一.该酶催化莽草酸磷酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）产生5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸和无机磷酸的可逆反应,受除草剂草甘膦（N-（膦羧甲基）甘氨酸）抑制.纯化了核盘菌AROM蛋白并对EPSP合酶进行了酶学特征研究.结果显示,该酶反应的最适pH值为7.2,最适温度为30℃.热失活反应活化能是69.62 kJ/mol.底物S3P和PEP浓度分别高于1 mmol/L和2 mmol/L时,对EPSP合酶反应产生抑制作用.用双底物反应恒态动力学Dalziel方程求得的Km(PEP)为140.98 μmol/L,K _m(S3P)为139.58 μmol/L.酶动力学模型遵循顺序反应机制.草甘膦是该酶反应底物PEP的竞争性抑制剂（Ki为0.32 μmol/L）和S3P的非竞争性抑制剂.正向反应受K⁺激活.当［K⁺］增加时,K _m(PEP)随之降低,Km(S3P)不规律变化,而K _i(PEP)随［K⁺］增加而提高.     

Zn^2＋对鸡蛋果细胞质丙酮酸激酶的抑制作用

Zn2 抑制鸡蛋果 ( Passiflora edulis Smis)长成叶与幼叶细胞质丙酮酸激酶 ( PKC)活性 ,抑制程度决定于 Mg2 浓度大小。Zn2 的抑制作用在长成叶 PKC与幼叶 PKC之间表现出一定差异 :当改变 PEP或 ADP浓度时 ,以双倒数作图 ,Zn2 对长成叶和幼叶 PKC均表现为反竞争性抑制 ,但抑制常数不同。Zn2 对长成叶 PKC的抑制常数为 Ki ( PEP) =0 .0 5 9mmol/L,Ki ( ADP) =0 .0 74 mmol/L,对幼叶 PKC的抑制常数 Ki ( PEP) =0 .0 38mmol/L,Ki ( ADP) =0 .0 2 mmol/L。Zn2 对长成叶 PKC与幼叶 PKC的 Ki( Mg2 )亦不同 ,分别为 0 .0 1 6mmol/L和0 .0 0 8mmol/L。这些结果进一步证明长成叶 PKC与幼叶 PKC的酶学性质不同     

随机突变提高单胺氧化酶活性

前期获得了一个对底物美西律具有一定活性的单胺氧化酶突变体A-1(F210V/L213C)。为进一步提高其酶活性,利用MegaWHOP PCR构建了库容约为104的随机突变库。筛选后获得了一个最优突变酶ep-1,比活力为A-1的189%。选择性测定结果表明,酶的对映体选择性有较大提高,E值由101提高到282;动力学常数测定揭示,酶催化效率有较大提高,kcat/Km由0.001 51 mmol/(L?s)提高到0.002 89 mmol/(L?s)。和A-1酶相比,在所测定的11种胺类底物中,ep-1对其他7种底物的比活力有较明显提高,对其他4种底物的比活力变化不大。序列分析表明,ep-1的突变为T162A。分子动力学模拟结果提示,该突变主要通过修正通道氨基酸的二级结构和扩大活性口袋来发挥作用。     

人直肠癌β-葡糖苷酶同工酶的动力学研究

 本文对人直肠癌及癌旁组织(对照)的β-葡糖苷酶同工酶的分离、底物动力学和某些物质的影响做了初步探索。结果表明:在这两种组织中分别存在三种同工酶。一种是胞液酶,Km值为1.18mmol/L(对照为1.13mmol/L),受NaCl和抗癌药WB非竞争性抑制;第二种是溶酶休可溶性酶,Km值为2.38mmol/L(对照为2.94mmol/L),不受NaCl影响,受WB的混合型抑制,直肠癌此酶受顺铂的竞争性抑制;第三种是溶酶体膜结合酶,受NaCl激活,使底物动力学由负协同性酶变为米氏酶。肿瘤组织中三种同工酶活性均高于癌旁组织中相应的酶活性。     

马齿苋叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性及调节特性的光/暗变化

在光照条件下C_4植物马齿黄金苋叶片PEPC的提取活性高于在黑暗中的。PEPC的光/暗活性比率与测定系统的pH及底物PEP浓度有关。pH升高及PEP浓度增加均可使光/暗活性比值下降。日间提取的PEPC与夜间提取的PEPC对于激活剂G6P及抑制剂Mal的敏感性有明显差异。日型PEPC的敏感性低于夜型PEPC的。G6P对PEPC的激活作用表现为增加酶对底物PEP的亲和性,Mal的抑制作用表现为既降低酶对底物PEP的亲和性,又降低酶促反应的最大速度。G6P、Mal对于日型和夜型PEPC的动力学参数的影响是不同的。     

低温胁迫对水稻幼苗PEP羧化酶的影响

水稻幼苗经低温(0℃)处理后,叶片中PEP羧化酶活性明显地降低.Km值增大。经1—2天低温处理者,增加反应底物的浓度,有减少PEP羧化酶活性降低的幅度;当低温伤害严重时(0℃4天),这种效应则消失。这些结果表明:水稻叶片中PEP羧化酶对低温反应是敏感的,其活性的下降是由于该酶对底物的亲和力的降低。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶反应条件的优化

优化了重组毕赤酵母表达的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化L-甲硫氨酸(Met)和ATP合成 S-腺苷甲硫氨酸的条件,确定了该酶的最适酶活力检测条件为20mmol/L的L -Met,26mmol/ L的ATP,52mmol/L的MgCl2,300mmol/L的KCl,8mmol/L的还原型谷胱甘肽,100mmol/ L的Tris,反应液pH 8.5,35°C反应 1h,比活力达到23.84U/mg.该酶还可以催化以DL-Met代替L-Met为底物的S-腺苷甲硫氨酸合成反应,以降低生产成本.     

正交试验法确定测定意大利蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶反应的最佳条件

用正交试验法研究了酶浓度、底物浓度、反应体系的pH值、反应温度和反应时间5个因素对测定意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica Spinola头部乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响, 并从试验组合中选出最佳条件。蜜蜂AChE活性的测定采用Gorun(1978)改进的Ellman方法, 以碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)为底物, 5, 5' 二硫双硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂, 测定反应物在412 nm波长下的光密度值, 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量, 经计算得到蜜蜂头部AChE的比活力。对正交试验结果进行极差分析和方差分析, 结果表明各因素对实验结果影响的大小顺序为：温度＞pH值＞时间＞酶浓度＞底物浓度。并得出测定蜜蜂头部AChE活性的最佳条件是：酶终浓度0.2头/mL、底物终浓度0.8 mmol/L、pH值7.5、温度40℃及反应时间5 min。     

高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究

筛选到1株菊粉酶高产克鲁维酵母菌株,采用酵母高密度细胞发酵方法,最高菊粉酶产量达到288.78u/mL,比80～90年代国际上报道的克鲁维酵母菊粉酶最高产量高6.8倍。该酶的菊粉酶/转化酶活性比为1/24.72;菊糖m=13.3mmol/L,蔗糖Km=62.6mmol/L;最适反应pH值为4.4,但在pH3.8～5.6的范围内均保持了较高的活性,相当于最适pH值下活性的90%;最适反应温度为55℃,在50～575℃范围内能够保持较高活性,50℃下酶的半衰期约为16h;外加Mg2+提高酶活性11.28%。     

PEP羧激酶测定过程中影响草酰乙酸溶液稳定性的几个因素

草酰乙酸（OAA）是PEP羧激酶（PEPCK）和苹果酸脱氢酶可逆催化反应的底物或产物，也是PEP核化酶的反应产物。然而OAA在溶液中可以酮式和烯酸式两种互变异构体及其水合物形式存在，而只有酮式OAA才能作为酶的底物[1，2，5]。同时，OAA很容易通过非酶促脱羧反应而降解[4]。OAA的这种多型性和不稳定性，往往导致以它为底物或产物的酶类活性测定值偏低。作PEPCK脱按活性测定时，所用的OAA溶液皆需规配现用，并在起动反应时作OAA非酶促脱波速率的校正。然而，实验过程中OAA浓度往往随时间而下降，使反应系统中OAA水平出现明显…     

外源添加代谢中间体对产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵制备丁二酸的影响

考察了外源添加中间代谢产物对菌体生长及发酵产酸的影响,结果表明添加0.5g/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)时丁二酸产量最高。围绕产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵产丁二酸的代谢网络进行代谢通量分析,发现添加PEP后己糖磷酸途径(HMP)与糖酵解途径(EMP)的通量比由39.4∶60.3提高至76.8∶22.6,解决了丁二酸合成过程中还原力不足的矛盾,导致PEP生成草酰乙酸的通量提高了23.8%,丁二酸代谢通量从99.8mmol/(gDCW·h)增至124.4mmol/(gDCW·h),而副产物乙酸及甲酸的代谢通量分别降低了22.9%、15.4%;关键酶活分析结果表明,添加0.5g/LPEP后PEP羧化激酶比酶活达到1910U/mg,与对照相比提高了74.7%,而丙酮酸激酶的比酶活降低了67.5%。最终丁二酸浓度为29.1g/L,收率达到76.2%,比未添加PEP时提高了11.0%。     

大肠杆菌转酮醇酶分子改造及催化酒石酸半醛合成

转酮醇酶(transketolase, TK, EC. 2.2.1.1)是一种焦磷酸硫胺素和二价阳离子依赖性酶,可催化二碳单位的转移,可逆形成C–C键,在多酶催化生产化学品、药物前体和不对称合成方面有广泛应用。文中以大肠杆菌(Escherichia coli) K12转酮醇酶TKTA为研究对象,通过定点饱和突变和组合突变提升对非磷酸化底物的反应活性,并探索突变酶TKTA＿M催化合成酒石酸半醛。结果表明：突变酶TKTA＿M (R358I/H461S/R520Q)最适反应温度为32℃,最适反应pH为7.0,以D-甘油醛为受体底物的比酶活为(6.57±0.14) U/mg,是野生型比酶活((0.71±0.02) U/mg)的9.25倍。在酶学性质研究的基础上,设计20 mL的反应体系,以50 mmol/L 5-酮基-D-葡萄糖酸和50 mmol/L非磷酸化乙醇醛为底物,TKTA＿M催化合成酒石酸半醛,最终酒石酸半醛的产量为3.71g,摩尔转化率为55.34%。研究结果为生物质制备L-(+)-酒石酸提供数据支撑,同时为转酮醇酶催化非磷酸化底物提供了借鉴。     

基因工程菌1016氨基酰化酶的酶学性质研究

研究了基因工程菌 1 0 1 6所产的氨基酰化酶的酶学特性。该酶的拆分速率符合米氏方程 ,且在 0 .5mol/L的高底物浓度下 ,无底物抑制现象。 37℃时的米氏常数和最大反应速率分别为 0 .0 4 8mmol/L和 2 .1 78mmol/L·h。最适反应温度为 5 5℃。5 5℃时 ,Km为 0 .0 37mmol/L ,Vmax为 2 .5 5 8mmol/L·h。最适底物为乙酰蛋氨酸 ;热稳定性好。     

极耐热性乳酸脱氢酶高效表达、纯化及酶学性质

从海栖热袍菌扩增出编码乳酸脱氢酶的基因并将其插入热激载体pHsh构建表达质粒,在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达产生极耐热性乳酸脱氢酶Tm-LDH。基因表达产物通过热处理,可以一步获得接近电泳纯的重组酶。酶学性质研究表明,Tm-LDH的最适反应温度为95℃,最适pH 7.0;纯酶在90℃的半衰期为2 h,在pH 5.5–8.0之间最稳定;SDS-PAGE结果显示分子量为33 kDa,与理论推算值相吻合。以丙酮酸和NADH为底物时,相对于丙酮酸的Km值1.7 mmol/L,Vmax为3.8×104 U/mg;相对于NADH的Km值7.2 mmol/L,Vmax值为1.1×105 U/mg。Tm-LDH基因在T7载体中未能实现高效表达,但是在热激载体pHsh中得到了可溶性超量表达,表达水平达到340 mg/L。该酶在65℃反应条件下,活性达到最高活性的50%,并能保持活性不变,这使该酶能够与常温酶匹配,在辅酶NAD再生体系的建立中具有广泛的用途。     

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。     

冻融产氨棒杆菌细胞转化法制备三磷酸腺苷

微生物发酵和酶转化法是工业上制备三磷酸腺苷(ATP)的有效途径。以腺嘌呤为关键底物,用冻融通透化处理的产氨棒杆菌细胞转化制备ATP,用高效液相色谱(HPLC)法检测ATP含量,考察各种转化条件对ATP产率的影响,确定最优转化条件:菌体用量40 g/L,底物6 g/L,葡萄糖60 g/L,Mg SO415 mmol/L,KH2PO4120 mmol/L,反应液p H 7.4,反应温度35℃。在最优转化条件下,ATP产率达到85.00%,比优化前提高了58%,细胞用量大幅度降低,优化条件稳定可行。     

白蚁肠道元基因组来源高温β-葡萄糖苷酶Bgl17的酶学性质

【目的】对短角球白蚁(Globitermes brachycerastes)肠道元基因组文库中筛选得到的一个新型β-葡萄糖苷酶编码基因bgl17进行酶学性质研究。【方法】通过克隆与异源表达得到纯的Bgl17酶蛋白,根据Bgl17对底物的水解活性测定其稳定性及动力学参数,利用薄层层析确定其水解产物。【结果】该酶属于糖基水解酶第一家族(GHF1),对其特异性底物4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPGlc)的最适反应温度为70 °C,最适pH为5.0。在最适反应条件下,该酶以pNPGlc为底物比活力为115.69 U/mg,以水杨苷为底物比活力为297.39 U/mg。以pNPGlc为底物时,其动力学参数Km值和Vmax分别为0.81 mmol/L和227.27 μmol/(mL·min)。在稳定性方面,该酶在50 °C处理1 h仍可保持50%的活性,在pH 5.0和6.0条件下,该酶的半衰期为1 h。【结论】该酶在较高的温度下具有较高的活性,且对水杨苷水解活性高,这点不同于已知的β-葡萄糖苷酶,推测其更有利于木质纤维素复杂结构的降解;该酶的最适温度远高于白蚁生存环境温度,可为研究白蚁降解纤维素的机理提供参考。     

黑翅土白蚁乙酰胆碱酯酶最佳反应体系的建立及药剂敏感度比较

用正交试验方法研究了酶浓度、底物浓度、反应体系pH值、反应温度、反应时间5个因素对黑翅土白蚁Odontotermes formosanus (Shiraki)乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定的影响。通过对正交试验结果进行极差和方差分析,明确了测定黑翅土白蚁AChE活性的最适反应条件是酶浓度为12.5 g/L,底物浓度为8 mmol/L,pH值8.0,反应温度40℃,反应时间5 min。此外,研究了6种药剂对黑翅土白蚁体内AChE活性的影响。结果表明：灭多威、辛硫磷、三唑磷、丙溴磷、马拉硫磷和氧化乐果6种药剂对黑翅土白蚁AChE抑制中浓度(IC₅₀)分别为3.52×10^-4,1.86×10^-3,5.13×10^-3,9.55×10^-4,8.81×10^-3,和1.39×10^-2 mol/L。在3.3×10^-7～5×10^-3 mol/L的浓度范围内,上述6种药剂对黑翅土白蚁体内AChE活性的抑制作用都具有明显的剂量效应关系。     

S-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化及其应用

为提高S-2-氯丙酸脱卤酶的活力,通过易错PCR的方法将源于假单胞菌(Pseudomonas sp.CGMCC 3267)的脱卤酶(DehII)进行定向进化,进化酶DehII-B2的比活提高3.9倍。同源模建两者的三维结构,并与底物进行分子对接。结果表明,突变位点为A7I,进化酶DehII-B2的结合能比原始酶降低了1.4kcal/mol,活性中心Asp10与底物α碳原子的距离缩短了0.321 6nm,因而加快了酶反应速率、提高了酶比活。目前,该酶的比活高于实验室已得酶。与原始酶相比,其最适温度和热稳定性略有增加,最适pH和pH稳定性没有明显变化。对该酶的应用做了初步的探索,结果表明在40℃,60mmol/L底物浓度下反应10h,转化率达到49.6%,ees>99.9%,因此该酶有一定的应用价值。     

无机磷影响叠氮钠对ATP合成酶合成活性的抑制

利用ADP和放射性磷直接合成ATP的方法,研究了无机磷(P_i)和叠氮钠对猪心线粒体ATP合成酶（F₁F_O-ATPase）ATP合成活性的影响.结果发现无机磷除作为合成ATP的底物参与F₁F_O-ATPase的合成反应外,还对F₁F_O-ATPase的合成活性呈现抑制作用,在1 mmol/L ADP存在时,随着P_i浓度由0.01～10 mmol/L增加,抑制合成作用越来越强.与叠氮钠在低浓度时(小于1 mmol/L)只抑制ATP水解,不影响ATP合成的观点不同.实验结果显示0.1 mmol/L叠氮钠表观激活F₁F_O-ATPase的ATP合成活性,且激活程度与反应体系中所加P_i的浓度呈负相关.当固定P_i浓度（0.1 mmol/L）后,随着叠氮钠浓度的增加表观激活程度也在变化,叠氮钠与磷浓度相等时表观激活程度最大,直至叠氮钠浓度接近0.5 mmol/L时,开始呈现表观抑制现象,叠氮钠浓度高于1 mmol/L之后,就出现解偶联现象.