体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞方向分化

探讨成纤维生长因子-2(FGF-2)在体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向肝细胞样细胞分化的作用及量化关系。体外分离培养大鼠BM-MSCs,将第3代BM-MSCs采用不同剂量的FGF-2诱导。诱导后,在显微镜下观察细胞形态学的改变;用免疫细胞化学法检测白蛋白和CK19的分泌;Shiff染色法检测糖原的分泌。诱导后BM-MSCs由梭形向多角形、卵圆形方向变化,白蛋白、CK19和糖原12 d即有阳性表达,以后随着诱导时间的延长阳性率逐渐升高。20 ng/mL FGF-2诱导比10 ng/mL FGF-2诱导细胞白蛋白、CK19和糖原的表达量均多。20 ng/mL FGF-2具有较强的诱导BM-MSCs向肝细胞样细胞分化的能力。     

表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的体外研究

目的:研究表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的可能性。方法:体外培养骨髓间充质干细胞,利用流式细胞仪分析其细胞表型。采用含EGF的培养液诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化,并利用免疫荧光法进行鉴定。结果:从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到神经干细胞标志物nestin、神经胶质细胞标志物GFAP和视网膜光感受器细胞标志物Rhodopsin呈阳性表达的细胞。结论:从骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。     

诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

选用Wistar大鼠分离骨髓间充质干细胞作体外培养及鉴定其表达抗原CD44、CDw90;采用10μmol／L 5-氮胞苷诱导第1代的骨髓间充质干细胞,于诱导后2、4周进行免疫细胞化学反应检测α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T。证实体外培养的第1代骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞,为指导体外诱导的心肌细胞应用于。临床提供一定的理论依据和技术手段。     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞

观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)植入体内后,在心肌微环境诱导下分化为心肌细胞的能力。无菌条件下取出大鼠双侧股骨及胫骨,冲洗骨髓腔获得细胞,贴壁筛选法纯化MSCs,体外培养、扩增,4,6-二咪基-4-联苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记细胞,注入结扎冠脉左前降支所致心肌梗塞模型鼠的心肌组织。在不同时间点处死大鼠,获取心肌组织,采用HE染色和电镜技术对植入MSCs进行形态学观察和超微结构检测,荧光免疫组化检测植入MSCs肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性抗原Cx43的表达,同时应用RT-PCR技术检测心脏早期发育基因NKx2．5、GATA-4的表达。结果发现细胞标记效率为100％,通过连续检测MSCs植入后细胞形态从无规则状态、幼稚细胞表型逐渐向成熟心肌细胞方向转化,植入细胞排列同正常肌纤维方向平行,且植入四周后电镜检测到闰盘的存在;两周出现MHC的表达,后随时间延长表达逐渐增强。四周出现Cx43的表达,以后表达稳定,RT-PCR检测NKx2．5、GATA-4在一天即出现弱表达,两周～三周时表达最强,以后强度逐渐减弱。结果表明MSCs在体内微环境条件下能够转化为心肌细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的免疫细胞化学研究

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)分离、纯化和体外诱导分化为脂肪细胞。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养、定期换液,分离纯化出生大鼠MSC,传代扩增,并用免疫细胞化学法鉴定大鼠MSC的表面抗原。含地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和胰岛素的培养液诱导MSC分化后,油红O染色鉴定。结果 大鼠MSC体外扩增10代以上,稳定表达CD44、CD54、CD106。油红O染色显示诱导后,71.2％有脂滴积聚。结论 从大鼠骨髓分离、纯化、体外诱导培养MSC,可定向分化为脂肪细胞表型。     

体外诱导大鼠脂肪间充质干细胞向肝细胞方向分化的研究

目的:探讨大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)是否可以在体外被诱导向肝细胞方向分化。方法:从大鼠脂肪组织中分离出干细胞,行体外扩增、传代;用免疫荧光染色法检测其表面标志,用成纤维细胞生长因子(FGF-4)和肝细胞生长因子(HGF)诱导其向肝细胞分化;倒置显微镜观察细胞形态变化,诱导后14天和21天分别用免疫荧光检测法检测肝细胞标志物白蛋白的表达,每次换液时留取培养上清用尿素氮测试盒检测尿素氮含量。结果:免疫荧光检测显示从脂肪组织所获取的细胞表面标志CD29阳性,而CD31和CD145均为阴性;诱导14天后可逐渐观察到肝细胞样形态改变;免疫荧光检测到白蛋白表达;尿素氮检测显示诱导组尿素氮含量随时间延长而逐渐升高。结论:从大鼠脂肪组织中获取的脂肪间充质干细胞能在体外被诱导分化成形态、表型及功能与肝细胞相似的细胞。     

体外化学诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

To investigate the potential of adult mesenchymal stem cells (hMSCs) derived from human bone marrow to undergo cardiomyogenic differentiation after exposure of 5-azacytidine in vitro. A small bone marrow aspirate was taken from the iliac crest of human volunteers, and hMSCs were isolated by 1.073 g/mL Percoll and cultured in the right cell culturing medium as previously described. The phonotypes of hMSCs were identified by flow cytometry. The stem cells were cultured in cell culture medium (as control) and medium mixed with 5-azacytidine (5-aza, 3, 5, 10 micromol/L) (n=5, respectively) for cellular differentiation. We examined respectively with immunohischemistry at 21 days of inducement on desmin, cardiac-specific cardiac troponin I (cTnI), GATA4 & connexin43. The ultrastructures of induced cells were examined by transmission electron microscope. The results indicated that the hMSCs showed a fibroblast-like morphology with vortex distribution in their peak propagation, and express high level of CD44 but negative for CD34 and CD45. 20%-30% cells grown after 5, 10 microl/L 5-aza treatment connected with adjoining cells and coalesced into myotube structures after 14 days. After 21 days of culturing, immunohistochemistry revealed expression of desmin, GATA4, cTnI and connexin43 in 5, 10 micromol/L showed positive, but no cardiac specific protein were found in neither 3 micromol/L nor in control group. The ratio of cTnI positive stained cells in 10 micromol/L group were higher than that in 5 micromol/L group (65.3+/-4.7% vs 48.2+/-5.4%, p<0.05). Electron microscopy revealed myofilaments were formed. The results indicated that purified hMSCs from adult bone marrow can be differentiated into cardiac-like muscle cells with 5-aza inducement in vitro and the differentiation is in line with the 5-aza concentration.     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究

无论是在体外实验、还是在体内实验,MSCs都可以向中枢神经系统(CNS)神经细胞分化,但争议颇多。因为功能性神经元不仅要具有典型神经元的形态、特异性标记,还要求具有可兴奋性、能和其他神经元形成突触联系、产生突触电位等,所以对于骨髓间充质干细胞是否能诱导出真正具有功能的神经元存在很大分歧。在此对MSCs向神经细胞诱导分化研究的现况、存在的问题及发展前景给以综述。     

体外化学诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

为了探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养及化学诱导向心肌细胞分化的过程及条件,我们用1.073g/mL密度梯度离心法分离健康人骨髓单个核细胞,经骨髓间充质干细胞培养基传代培养后用流式细胞仪检测细胞表面抗原,在完全培养基中分别加入3、5、10μmol/L的5氮胞苷(每组n=5)进行化学诱导分化,阴性对照组采用完全培养基培养,诱导后21天细胞爬片免疫荧光法鉴定,透射电镜观察细胞超微结构。结果显示人MSCs为形态均一的梭形细胞,生长旺盛时呈旋涡样分布,流式细胞仪检测细胞表面CD44阳性,CD34、CD45阴性;5、10μmol/L的5氮胞苷进行化学诱导后细胞形态变长,诱导后14天时20%-30%细胞融合形成多核肌管样结构,3μmol/L组MSCs未出现肌管结构,诱导后21天5、10μmol/L组MSCs中desmin、心肌早期转录因子GATA4、心肌特异性cTnI及闰盘蛋白connexin43的表达阳性,10μmol/L组cTnI阳性染色细胞数目(65.3±4.7%)高于5μmol/L诱导组(48.2±5.4%)(p<0.05);3μmol/L组及阴性对照组无心肌特异性蛋白的表达。细胞诱导后28天透射电镜下可见肌丝形成。本实验说明,人MSCs在体外经化学诱导可分化为心肌样细胞,而且5-氮胞苷对于心肌相关蛋白的表达呈浓度依赖性正相关。     

Tie-2单克隆抗体鉴定人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化的内皮细胞

目的:体外扩增和定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向内皮细胞分化,并探讨其可行性和条件.方法:利用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离MSCs,用含10?S的LG-DMEM培养基进行纯化和扩增培养,流式细胞仪分析鉴定MSCs的纯度.用含VEGF(10μg/L)的HGDMEM培养基诱导MSCs向内皮细胞定向分化,Tie-2单克隆抗体的免疫组化法和透射电镜(TEM)鉴定其细胞的性质.结果:5.0×105个MSCs在体外扩增15代后,获得了8.0×1012个MSCs,扩增了约1.6×107倍.加入诱导培养体系培养14～21 d,光镜下可观察到内皮细胞呈典型的"鹅卵石"样:90%的细胞Tie-2免疫组化呈阳性反应;TEM下可观察到胞浆内有Weible-palade小体.结论:成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为内皮细胞的潜能,为构建心脏组织工程瓣种子细胞的来源提供了可能性.     

间充质干细胞体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化

研究间充质干细胞(MSC)能否在体外调控造血。体外分离培养人骨髓来源的MSC,RT-PCR检测其造血生长因子的表达,并以其为饲养层细胞,接种骨髓单个核细胞(MNC),观察生长情况,并通过形态学观察和流式细胞术分析,鉴定细胞来源和分化方向。结果显示,MSC构成性表达SCF、Flt3L和M-CSF,不表达C-CSF和GM-CSF,在骨髓MNC和MSC共培养体系中,大约2周左右可以看到大量的圆形细胞粘附在梭型MSC上生长,细胞胞体为圆形,胞浆较丰富,胞核为圆形、半月型或肾型,部分细胞呈典型的单核细胞形态,流式细胞术分析该类细胞表达CDl4,不表达CDl5、CD41、glycophorin A、CD5和CDl9。表明不需要添加外源性造血生长因子,间充质干细胞能在体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化,其定向分化可能与MSC分泌造血生长因子及MSC与造血细胞间相互作用有关。     

胎肝滤液诱导大鼠胎盘间充质干细胞向肝细胞的分化

目的探讨PDMSCs向肝细胞增殖和分化的体外培养条件及方法。方法孕20 d的大鼠无菌条件下取胎盘,经胶原酶消化、密度离心、贴壁筛选法分离培养胎盘源间充质干细胞,并对其表面抗原进行鉴定。在体外培养体系中加入胎肝滤液,模拟体内肝脏微环境,诱导PDMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学检测干细胞标志物;PAS检测糖原表达。结果在体外培养条件下,PDMSCs贴壁生长为成纤维样细胞,CD44表面标志物检测阳性;PDMSCs经胎肝滤液诱导14d时细胞呈现圆形、卵圆形的特征性改变,AFP、CK19表达阳性。结论胎肝滤液能够诱导PDMSCs定向分化为肝细胞样细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的研究

通过体外诱导人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)向多巴胺(dopamine,DA)神经元分化,探讨人BMSCs来源的DA神经元的功能特征及其分化机制,为临床上细胞移植替代治疗诸如帕金森氏病(parkinson’sdisease,PD)等神经精神性疾病提供一种理想的细胞来源。通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs。50μmol/L脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophy factor,BDNF),10μmol/Lforskolin(FSK)和10μmol/LDA联合对BMSCs进行诱导。电子显微镜观察诱导2周后细胞是否具有神经元的超微结构特点;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测DA神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3和Lmx1b的表达;高效液相色谱(highperformance liquid chromatogram,HPLC)检测诱导2周后的细胞多巴胺的释放水平。结果表明,诱导2周后,电镜下细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成。RT-PCR结果显示NSE(neuron specificenolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学染色结果表明诱导2周后TH阳性细胞(24·80±3·36)%的表达较诱导3d后(3·77±1·77)%明显提高(P<0·01);HPLC检测到诱导2周后的细胞DA释放水平[(1·22±0·36)μg/mL(n=6)]高于未经诱导的细胞[(0·75±0·22)μg/mL(n=6)(t=-2·79,P=0·038)]。由此得出,BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs向DA神经元分化,并具有DA神经元的功能特征,是临床用于治疗神经精神性疾病的理想细胞来源。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的研究

通过体外诱导人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向多巴胺(dopamine, DA)神经元分化,探讨人BMSCs来源的DA神经元的功能特征及其分化机制,为临床上细胞移植替代治疗诸如帕金森氏病(parkinson's disease, PD)等神经精神性疾病提供一种理想的细胞来源。通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs。50μmol/L脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophy factor, BDNF),10μmol/L forskolin(FSK)和10μmol/L DA联合对BMSCs进行诱导。电子显微镜观察诱导2周后细胞是否具有神经元的超微结构特点;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测DA神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH）的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3和Lmx1b的表达;高效液相色谱（high performance liquid chromatogram, HPLC）检测诱导2周后的细胞多巴胺的释放水平。 结果表明,诱导2周后,电镜下细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成。RT-PCR结果显示NSE(neuron specific enolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学染色结果表明诱导2周后TH阳性细胞(24.80±3.36）%的表达较诱导3d后(3.77±1.77)%明显提高(P<0.01）;HPLC检测到诱导2周后的细胞DA释放水平［(1.22±0.36)μg/mL(n＝6)］高于未经诱导的细胞［(0.75±0.22)μg/mL(n＝6) (t＝－2.79,P＝0.038)］。 由此得出,BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs向DA神经元分化,并具有DA神经元的功能特征,是临床用于治疗神经精神性疾病的理想细胞来源。     

成纤维生长因子-2与肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的作用比较

比较成纤维生长因子-2(FGF-2)与肝细胞生长因子(HGF)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向肝细胞分化的能力,并进一步的研究BM-MSCs诱导成肝细胞所需的最佳诱导因子以及其用量。体外获取、培养大鼠BM-MSCs,将第3代BM-MSCs采用不同剂量的FGF-2和HGF诱导。诱导后,在显微镜下观察细胞形态学的改变;Shiff染色法检测糖原的分泌;ELISA法检测AFP的分泌;免疫细胞化学法检测白蛋白和CK19的分泌。诱导后BM-MSCs由梭形向多角形、卵圆形方向变化,AFP第3天就有分泌,第12天达到高峰,以后逐渐减少;白蛋白、CK19和糖原第12天即有阳性表达,以后随着诱导时间的延长阳性率逐渐升高。第2组和第4组比其他组分泌的白蛋白、CK19和糖原均多。FGF-2比HGF具有更强的诱导BM-MSCs向肝细胞分化的能力。     

CTLA4基因修饰骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化及其免疫抑制功能研究

用携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stern cels,BMMSCs),体外向肝细胞诱导分化,并检测其免疫抑制功能.用含有HGF等细胞因子培养液诱导重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMMSCs向肝细胞分化.诱导后的细胞可表达AFP、Alb和CK18等肝细胞标志,同时还具有储存糖原和摄取、排泌靛青绿等肝细胞功能.转基因BMMSCs在未经诱导和诱导后均可表达CTLA4Ig,诱导14天时表达量有所减弱.单向混合淋巴细胞反应证实,诱导7天的转基因BMMSCs具有明显的抑制淋巴细胞反应的作用,其抑制作用明显高于未转基因BMMSCs,且CTLA4Ig基因修饰BMMSCs输注还可以明显延长肝移植大鼠的存活时间.用重组腺病毒Ad-CTLA4Ig对BMMSCs进行基因修饰,一方面不会影响BMMSCs的肝细胞分化潜能,另一方面使BMMSCs的免疫抑制特性得到进一步强化.     

川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

为了探讨川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞的作用,以小鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,实验分为空白对照组、β-巯基乙醇（BME）阳性对照组和川芎嗪诱导组。采用荧光免疫化学和Western blot方法,分别检测神经干细胞巢蛋白（nestin）和经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达;RT-PCR检测诱导不同时间对神经细胞相关基因Nestin、NSE、β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和核受体相关因子-1（Nurr1）mRNA表达的影响。结果显示川芎嗪诱导间充质干细胞24 h后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞。细胞死亡率低于β-巯基乙醇诱导组。免疫荧光化学法和western blot结果显示：川芎嗪诱导后的细胞nes-tin和NSE蛋白表达呈阳性,且表达丰度显著高于β-巯基乙醇诱导组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl。结果表明川芎嗪能定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,是较理想的诱导剂。     

中药诱导骨髓间充质干细胞多向分化研究进展

干细胞（stem cell）是指具有自我更新、高度增殖及多分化潜能的未分化细胞,它能产生出表型与基因型完全相同的子细胞,是机体其他细胞的起源。根据其发展阶段和来源不同,干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。     

间充质干细胞向软骨细胞表型分化的研究进展

关节软骨自我修复能力有限,目前临床用于治疗关节软骨损伤的方法和药物均难以达到满意的效果.间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便等特点,可能成为软骨组织工程的理想种子细胞之一.就间充质干细胞在软骨表型分化方面的研究进展进行了综述.系统地介绍了影响间充质干细胞向软骨细胞分化的诸多因素,如:生长因子、氧...     

骨髓间充质干细胞可塑性研究

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs）具有跨系统、甚至跨胚层分化的特性,称为MSCs的可塑性（plasticity）,成为细胞工程、再生医学中的主要选择细胞。但随着对成体干细胞可塑性质疑的出现,使MSCs是否具有转分化能力,存在着极大的分歧。对MSCs可塑性是否真正存在的进一步明确,越加显得急切和重要,也对干细胞基础理论及其临床应用具有指导性意义。