呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。     

卡他莫拉菌实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]建立基于SYBR GreenⅠ染料法的卡他莫拉菌实时荧光PCR检测方法。[方法]选取卡他莫拉菌两个的基因(uspA1和copB)设计特异性引物;提取卡他莫拉菌、嗜肺军团菌等11种呼吸道病原体的DNA,通过常规PCR和实时荧光PCR对引物的特异性进行验证;以卡他莫拉菌DNA为模板进行实时荧光PCR,获取扩增曲线、标准曲线、熔解曲线和熔解峰图,并判断检测方法的灵敏度;进行重复性试验,评估检测方法的组内和组间重复性;通过模拟临床样本,对检测方法的灵敏度进行验证。[结果]共设计出3对引物,对嗜肺军团菌等10种呼吸道病原体具有特异性;对卡他莫拉菌的最低检出浓度为1.0×10^(3)cfu/mL;组内和组间最大变异系数分别为1.78%、1.89%;模拟的临床试验结果与预期相符。[结论]成功建立了卡他莫拉菌的实时荧光PCR检测方法,与10种常见的呼吸道病原体无交叉反应,且重复性变异系数小于2%,模拟临床试验灵敏度结果达到1.0×10^(3)cfu/mL。     

蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃.本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法.参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板.在对反应体系进行优化的基础上,建立了 KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证.结果显示:该方法能有效扩增8×100拷贝/μL～8×107拷贝/μL 的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1％和2％,重复性良好.应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR.本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持.     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

卫氏并殖吸虫PCR和实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的建立快速、灵敏、特异的分子生物学检测卫氏并殖吸虫的方法。方法根据卫氏并殖吸虫的特异性基因序列,设计适合于PCR检测的特异性引物及实时荧光PCR特异性引物和探针,并进行灵敏性和特异性试验。结果设计的引物和探针特异性强,所建立的检测方法灵敏度高。应用实时荧光PCR方法的检测灵敏度可达到0.1 pg/μL,比PCR方法的灵敏度高三个数量级。结论本研究所建立的PCR和实时荧光PCR技术检测卫氏并殖吸虫方法的特异性强,灵敏度高,为卫氏并殖吸虫感染的诊治提供了快速的检测技术手段。     

实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法检测肠道致病菌的比较

目的比较实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法检测肠道致病菌中沙门菌与志贺菌的结果并分析总结。方法对江苏盛泽医院2010年到2014年就诊的腹泻患者4 662例的粪便标本同时进行实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法检测,对其结果进行统计学分析,并对所有实时荧光定量PCR检测阳性标本进行常规细菌鉴定法检测,对所有结果进行分析与总结。结果实时荧光定量PCR法检测沙门菌阳性85株,阳性率为1.82%;志贺菌阳性192株,阳性率为4.12%;常规细菌鉴定法检测沙门菌阳性81株,阳性率为1.74%;志贺菌阳性184株,阳性率为3.95%,两种方法比较差异无统计学意义(P0.05)。对实时荧光定量PCR检测阳性标本进行常规细菌鉴定法检测,阳性率为100%。结论实时荧光定量PCR法检测沙门菌与志贺菌结果可靠,检测时间短,更能满足临床诊断肠道疾病的需求。     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

实时荧光PCR结合融解曲线分析快速鉴定临床常见曲霉菌

目的 采用实时荧光PCR结合融解曲线分析的方法快速将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平.方法 ①普通PCR扩增真菌ITS区后进行序列比对,准确鉴定菌种并设计种特异性引物和探针.②采用实时荧光PCR的方法及融解曲线分析,根据不同的解链温度将5种临床常见曲霉菌鉴定到种的水平.③特异性、敏感性、重复性试验.结果 ①解链曲线分析显示,不同种曲霉菌的种特异性探针有特异的Tm值,根据Tm值的不同可以将5种曲霉菌区分开来:烟曲霉Tm =61.4℃,黄曲霉Tm=57.4℃,黑曲霉Tm=67.7℃,土曲霉Tm=55.2℃和64.5℃,构巢曲霉Tm=65.8℃.其中小孢根霉和疣状瓶霉与烟曲霉探针发生交叉反应,阴性对照不出现特异性的解链曲线.②该方法对5种曲霉菌的检测下限分别为:烟曲霉56.8 fg,黄曲霉1 110fg,黑曲霉13.7 fg,土曲霉123 fg,构巢曲霉780 fg.③重复性试验结果显示,同一种曲霉菌的Tm值波动范围不超过0.5℃.结论 采用实时荧光PCR结合融解曲线分析的方法可以快速准确地将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平,具有良好的敏感性、特异性和可重复性,有助于临床侵袭性曲霉感染的诊断和指导抗真菌药物使用.     

鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法

研究建立了鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。依据鳕鱼的16S rRNA基因序列设计一对PCR引物及探针,对12种鳕鱼样品和71种非鳕鱼动植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,只有12种鳕鱼样品产生荧光信号,其他非鳕鱼样品均不产生荧光信号,实验表明此方法具有特异性,其检测限为0.01 ng/μl鳕鱼DNA和0.01%鳕鱼肉粉。对市售的鳕鱼样品进行实际样品检测,均能很好地检出鳕鱼成分。此法特异性强,灵敏度高,可作为鳕鱼成分鉴定的检测方法。     

GA21转基因玉米实时荧光PCR检测方法的建立

成功建立了实时荧光PCR鉴定检测转基因玉米GA21品系的方法。该方法通过GA21玉米品系的OTPmEPSPS边界的270bp和133bp靶序列,设计品系特异性检测引物和探针,同时针对Pactin1mEPSPS边界的430bp靶序列设计品系特异性检测引物,应用实时荧光PCR和PCR技术,特异性检测GA21玉米品系。结果表明,应用实时荧光PCR的TaqMan探针技术检测转基因作物边界序列,不仅可以达到品系鉴定的目的,而且该方法和常规PCR比特异性强,简便快速,同时实验采用完全闭管检测,又降低了污染机会,为转基因作物的品系鉴定检测提供了新方法。     

实时荧光PCR结果的四维杂交的核酸技术分析

本研究采用四维杂交试剂,测定PCR产物的特征熔点温度(temperature of melting point,Tmp),对实时荧光定量PCR所获得阳性信号(特异性的或非特异性的)的结果进行分析和确认,以使检测结论更客观.将荧光探针模式的实时荧光PCR检测后的标本再进行熔解曲线温度扫描,然后在4℃冰箱冷却5min,向反应管加入1μL四维杂交液,再按照温度扫描程序做熔解曲线实验.结果显示,加四维杂交试剂之后的熔解曲线中信号峰值是收敛的,且信噪比增大.相同扩增产物的Tmp的误差是在±1℃之内.实验结果证明,四维杂交试剂对荧光探针模式实时荧光PCR结果可进行更精细的分析和确认.     

实时荧光定量PCR方法检测小RNA

<正>Real-time QuantitativePCR Detecting System,即实时定量核酸扩增检测系统,也称为实时定量基因扩增检测系统,简称定量PCR(qPCR)。荧光定量PCR一般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR(以SYBR Green I为例)方法对小RNA进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小RNA的优点为:实验设计简单,一般需要一条特异性反转录引物,一条特异性正向PCR引物,反向PCR引物可通用于所有小RNA分析,无需象TaqMan方法那样专门设计探针;实验成本相对较低;可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术,而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下:     

SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测口腔幽门螺杆菌

目的建立一种快速、灵敏、特异的鉴定幽门螺杆菌实时荧光定量PCR方法。方法利用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系对口腔幽门螺杆菌进行检测。鉴定结果与临床常规鉴定方法相比较,评价其敏感度、特异度及重复性。结果通过48例样品的检测,结果显示实时荧光定量PCR法检测标本的鉴定结果与常规PCR鉴定方法的结果对比,特异度为100%,敏感度为100%;最小能检测到102个拷贝数的重组质粒;批内重复试验和批间重复试验结果均与常规鉴定方法结果相符。结论实时荧光定量PCR法鉴定口腔幽门螺杆菌,特异度和敏感度高,重复性好,且快速、简便。该方法有望成为检测口腔幽门螺杆菌感染的一种快速有效的方法。     

EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示:建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强,与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应;灵敏度高,最高可检测到10拷贝/μL的病毒量;重复性好,3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%;对118份临床样品进行检测,阳性样品25份,阳性率为21.2%,检测结果与普通PCR相符率为99.2%,其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性,普通PCR检测为阴性。结果表明,建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点,可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。【方法】利用实时荧光PCR技术,根据转基因棉花MON88701品系特异性序列设计引物和探针,建立转基因棉花MON88701实时荧光PCR检测方法,并测定本方法的灵敏度、特异性及可重复性。【结果】建立的检测方法特异于转基因棉花MON88701成分的检测,灵敏度测试表明其定量下限为34拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。【结论】本研究建立的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性和高灵敏度,适合对转基因棉花MON88701品系进行检测。     

应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的初步研究

目的:根据烟曲霉Mtol基因特异位点设计并合成探针及引物,建立应用实时荧光PCR检测烟曲霉的方法.方法:通过对多种病原曲霉Mtol基因序列的比对分析,在烟曲霉特异位点设计引物及探针,并对其进行特异性及敏感性进行验证.结果:通过对曲霉属26株不同曲霉菌及其他属的6株不同病原真菌的特异性验证未发现有交叉反应,敏感性实验显示应用该方法可检出1.08 X 10-6μg/ml的模板DNA.结论:实验建立了应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的方法,该方法具有特异、灵敏、快速等特点并能有效避免普通PCR中的样品间交叉污染问题.     

实时荧光定量TaqMan-MGB探针法检测杆菌样巴尔通体

【目的】应用Taq Man探针实时荧光定量PCR技术建立特异性强、敏感性高和稳定性好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因,从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较Ct值和荧光强度确定扩增反应的最佳退火温度、探针和引物浓度;将扩增产物连接到p EASY-T载体上制备标准品,绘制标准曲线,分析扩增效率和线性关系;评估方法的特异性、敏感性及重复性。【结果】优化后退火温度为60°C,探针和引物浓度均为200 nmol/L,反应体系20μL。特异性实验显示只有杆菌样巴尔通体扩增出荧光信号,其他种属细菌均未见荧光信号;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率E=98.18%;最低检出限为每个PCR反应3个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.21%–0.42%和0.29%–0.59%,在允许范围内。【结论】研究建立的实时荧光定量Taq Man-MGB探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速检测鉴定杆菌样巴尔通体,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

实时荧光PCR技术快速鉴别检测H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的研究

选取H5、H9、H7亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,利用PrimerExpress2.0软件设计了各自亚型的特异性引物和Taqman MGB探针,利用实时荧光RT-PCR一步法建立了H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的鉴别检测方法,该方法特异性好,重复性佳,对其他疫苗无交叉反应。结果表明实时荧光PCR方法为禽流感灭活疫苗提供了一种特异、敏感、快速和简洁的鉴别检测方法。     

实时荧光PCR快速检测食品中致敏原芹菜成分

探讨采用实时荧光PCK技术建立检测食品中致敏原芹菜成分的方法.试验结果表明:针对芹菜管家基因Mrd基因设计的特异性检测引物和探针进行检测时,31种样品经实时PCR扩增,只有芹菜和西芹样品产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号.灵敏度试验结果表明:该方法对芹菜致敏原基因的检测灵敏度较高,可检测到芹菜过敏原样品中10mg/kg～1mg/kg的含量.