营养胁迫下球形棕囊藻(Phaeocystis globosa Scherffel)的生长行为及溶血活性

近年来,我国广东沿海连续出现大面积球形棕囊藻(Phaeocystis globosaScherffel)赤潮,产生溶血毒素等有害物质,给当地的海洋养殖业造成重大的经济损失。研究不同的生长时期及半连续培养时不同营养盐胁迫下,球形棕囊藻溶血毒素的产生行为。结果显示,批量培养的球形棕囊藻处于生长平稳期末时,溶血活性最大((21±1)units/L);半连续培养时,营养盐限制对球形棕囊藻的生长有明显的抑制作用,其中Fe3 及N盐限制影响最为明显。同时,营养盐限制也可促进棕囊藻溶血毒素的合成,其中Fe3 和-Mn2 的限制性时球形棕囊藻溶血活性显著增强。这些结果表明,球形棕囊藻溶血毒素的产生与藻细胞的生长可能受不同机制的调节,溶血毒素的合成可能是环境胁迫下棕囊藻维持生存的一种策略。     

球形棕囊藻的生长特性及生活史研究

对球形棕囊藻不同的藻株(香港株HK和汕头株ST)在实验室条件下分别进行了形态学,生活史及生长曲线的研究,结果表明:球形棕囊藻具有一个复杂的异型生活史,具有两种不同的生活形态:群体和游离的单细胞,香港株和汕头株二者单细胞呈球形或近球形,直径大多为3-9μm;群体呈中空的球形囊泡,细胞包埋在胶质囊中较均匀分布,但二者群体大小有较大差异。当培养达到一定阶段,群体衰亡破裂释放大量单细胞。批次培养中球形棕囊藻的生长周期约为20-30d,香港株最适生长温度接近25℃,最大比生长率为038;汕头株的最适生长温度接近30℃,最大比生长率为042,这说明温度是重要的生长限制因子之一。       

二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质、DNA含量的影响

分析了二氧化氯(1.0、1.5、2.0、2.5mgL-1,作用96h;2.5、6.0、8.0、16.0mgL-1,作用60min)对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质含量、氨基酸组成、核酸含量的影响,用透视电镜对二氧化氯(0.5mgL-1,0.8mgL-1)作用24h后藻细胞形态的变化进行了观察,以探讨二氧化氯去除赤潮藻的机理。结果表明,二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质、DNA的含量均有影响。实验各组(1.0-2.5mgL-1,2.5-16.0mgL-1)球形棕囊藻的叶绿素a、蛋白质、DNA的含量均显著低于对照。二氧化氯浓度超过2mgL-1时,球形棕囊藻的叶绿素a、蛋白质、DNA的含量持续降低,氨基酸相对含量发生明显变化;半胱氨酸、酪氨酸和赖氨酸等的相对含量明显降低,而组氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸则明显增加。当二氧化氯(2.5-16.0mgL-1)作用3min后,DNA漏出率在13%-18%之间;电镜观察发现,二氧化氯可使细胞膜破损,引起内容物外泄。这些结果显示,二氧化氯能以单分子形式进入细胞,引起叶绿素、蛋白质结构的变化,并破坏藻细胞膜系统,最终导致藻细胞死亡。     

球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)叶绿体psaA基因片段的序列分析

根据GenBank中检索到的南极棕囊藻(Phaeocystis globosa)psaA基因序列设计psaAL和psaAR引物,对球形棕囊藻(Phaeocystis globosa),的psaA基因片段进行PCR扩增并测序,获得了629bp的DNA序列。应用clustal X对球形棕囊藻P1、P2株系和南极棕囊藻的psaA基因片段序列进行比对,结果表明,球形棕囊藻psaA基因片段序列无插入／缺失,核苷酸差异率为3.34％。应用DNAstar分析软件推断球形棕囊藻和南极棕囊藻的psaA基因对应的氨基酸序列和RNA二级结构,发现它们的氨基酸序列差异不大,序列中209个氨基酸只有1个发生了变化,其氨基酸变异率为0．48％;除部分结构域比较相似外,RNA二级结构上体现一定程度的差异,这可能对棕囊藻的分子分类研究有参考价值。因所获得的psaA基因片段序列及氨基酸序列具有种的极端保守性,不适宜用作Phaeocystis属种间的分子分类研究。     

海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离

海洋卡盾藻(Chattonella marina)是我国南方沿海主要的鱼毒性赤潮生物,近年来由该藻形成的赤成已造成多起近岸养殖鱼类大量死亡的事件。为了弄清该藻毒素的基本成分特征,本文研究了室内培养条件下海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取方法,观察了溶血毒素对红细胞的溶血过程,采用薄层色谱法对溶血成分进行了初步分析。结果表明:海洋卡盾藻藻细胞的超声波破碎最适条件为功率400W,4℃下处理15min;通过显微镜观察,证实提取的毒素对血红细胞膜具破坏作用;海洋卡盾藻合成的溶血毒素至少含有4种组分,其中1种可能为为脂类,3种为糖脂类。该研究成果有助于我国今后进一步开展鱼毒性赤潮生物毒素的研究。     

不同氮源对球形棕囊藻生长的影响

采用实验室培养的方法比较了6种不同氮源-硝态氮、尿素、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、腺嘌呤对典型赤潮藻球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)生长的影响。结果表明,6种氮源均能不同程度地促进球形棕囊藻的生长,但比生长速率和光合作用效率具有显著差异性。将球形棕囊藻在不同浓度氮源下的最大比生长速率分别拟合Monod方程,得出球形棕囊藻在硝态氮、尿素、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和腺嘌呤等6种氮源下的最大比生长率分别为1.05,1.17,0.82,0.87,1.09,0.90d^-1,相应的半饱和常数分别为9.132,23.758,85.519,7.104,23.94,10.959μmol/L。其中,高氮浓度(8820μmol/L)下腺嘌呤对球型棕囊藻的生长具有显著抑制作用。相比较而言,球形棕囊藻对甘氨酸的亲和力最高。当硝态氮、尿素、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和腺嘌呤的浓度分别为8820,882,882,8820,882,0.441μmol/L时,球形棕囊藻的最大光合效率(Fv/Fm)分别为0.619,0.620,0.579,0.595,0.648,0.667。由此可见,氮源对球形棕囊藻的生长和光合作用具有显著影响;球形棕囊藻能够利用多种无机和有机氮源,与其它仅能利用无机氮源的浮游植物相比,更具有竞争优势。     

硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响

以我国南海海域分离的赤潮原因种——球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)为材料,研究了不同硝酸盐浓度下藻细胞生长及硝酸还原酶活性的变化。当培养基中不含硝酸盐时,藻细胞内硝酸还原酶的活性保持在非常低的水平,藻细胞的生长受到限制,不能形成正常的生长曲线:当培养基中硝酸盐浓度为3.62μmol.L-1时,藻细胞的硝酸还原酶活性和比生长速率达到最大。在含有硝酸盐的培养基中,接种培养后第9天藻细胞硝酸还原酶活性达到最大值,并且在4种不同硝酸盐浓度下,藻细胞硝酸还原酶活性的差异性达到极显著水平(P<0.01)。在接种培养第16天藻细胞密度达到最大值,并且4种不同硝酸盐浓度培养的藻细胞密度之间的差异性也达到极显著水平(P<0.01)。实验结果表明,在培养基中添加不同浓度的硝酸盐,对球形棕囊藻细胞硝酸还原酶的活性和藻细胞的生长有极显著的影响,含有较高硝酸盐的富营养化海域有利于球形棕囊藻细胞的持续生长。     

硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响

以我国南海海域分离的赤潮原因种——球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)为材料, 研究了不同硝酸盐浓度下藻细胞生长及硝酸还原酶活性的变化。当培养基中不含硝酸盐时, 藻细胞内硝酸还原酶的活性保持在非常低的水平, 藻细胞的生长受到限制, 不能形成正常的生长曲线: 当培养基中硝酸盐浓度为3.62 mmol.L-1时, 藻细胞的硝酸还原酶活性和比生长速率达到最大。在含有硝酸盐的培养基中, 接种培养后第9天藻细胞硝酸还原酶活性达到最大值, 并且在4种不同硝酸盐浓度下, 藻细胞硝酸还原酶活性的差异性达到极显著水平(P<0.01)。在接种培养第16天藻细胞密度达到最大值, 并且4种不同硝酸盐浓度培养的藻细胞密度之间的差异性也达到极显著水平(P<0.01)。实验结果表明, 在培养基中添加不同浓度的硝酸盐, 对球形棕囊藻细胞硝酸还原酶的活性和藻细胞的生长有极显著的影响, 含有较高硝酸盐的富营养化海域有利于球形棕囊藻细胞的持续生长。     

稻、麦秸秆对球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)生长的抑制作用

考查了秸秆及其浸出液对球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)生长的影响,分析了秸秆附着微生物及秸秆物理吸附作用对秸秆抑藻活性的影响,观察了稻杆浸出液对藻细胞形态的影响。结果显示,一定量的物理破碎稻杆、麦杆及其浸出液均可有效抑制棕囊藻的生长,灭菌与未灭菌秸杆之间抑藻效果相差不大。不同条件处理的秸杆浸出液总酚含量与抑藻作用间均存在很大差异,但两者之间并无明显相关性。原子力显微镜观察发现,秸秆处理组细胞膜破裂、细胞塌陷,结构不完整,细胞粗糙度明显增加。这些结果提示微生物和物理吸附对秸杆抑藻作用的贡献很小,秸秆中存在的或降解产生的抑藻活性成分是秸秆抑藻的主要原因;除了酚酸类物质外,秸杆中可能存在其他可以显著抑制藻类生长的物质;秸秆通过破坏藻细胞的膜结构,导致藻细胞出现空洞,细胞内容物流出,从而抑制或杀灭藻细胞。     

球形棕囊藻的生长、囊体形态以及囊体细胞的分布

球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)是中国近海海区常见有害藻华原因种, 其异型生活史中包含单细胞和球形囊体两种形态。游离单细胞直径一般为几微米, 囊体最大直径可达3 cm, 巨大的体积可能导致囊体具有特殊的结构和细胞分布。以球形棕囊藻汕头株为研究对象, 测定了囊体直径、囊体细胞丰度和游离单细胞丰度, 并探讨球形棕囊藻囊体形态与细胞分布的关系。研究结果表明, 囊体形态在其异型生活史中占优势, 囊体对生物量的贡献介于38%–95%之间, 在对数生长期的后期和稳定期, 囊体细胞与单细胞相比占绝对优势。囊体细胞数量与囊体直径的对数呈线性相关, 回归线斜率为1.34, 该值显著低于世界海区其它球形棕囊藻株系的研究结果, 表明汕头株单位囊体表面上分布的细胞数更少。中国海区的球形棕囊藻囊体结构和细胞分布与其它株系不同, 在爆发球形棕囊藻的海区, 巨大的囊体能够有效地抵御摄食, 可能对区域海洋食物链结构和功能有重要影响。     

Characterization of the Hemolytic Properties of an Extract from Phaeocystis globosa Scherffel

Phaeocystis globosa Scherffel, an organism that causes harmful algal blooms, is a genus of the family Prymnesiophyta (or Haptophyta) with eurythermal and euryhaline characteristics. P. globosa has been confirmed to produce hemolytic substances, which are a mixture of liposaccharides. In the present study, the hemolytic properties of extract ofP. globosa are analyzed further. The effects of temperature, pH,different divalent cations, and membrane lipids on extract-induced hemolysis are discussed, as is the possible hemolytic mechanism. The results of the present study showed that the hemolytic activity of the extract was approximately 127.1 hemolytic units (HU)/L. The hemolytic reaction became fastest and a 50% decrease in absorbance was induced at 30 min at 37 ℃, and at pH 7.0; Hg2 was the strongest inhibitor of the hemolysis compared with the other divalent cations and many membrane lipids, except for phosphatidic acid, inhibited the hemolytic activity to different degrees. These results suggest that the toxin may make pores in the surface of red blood cells and that Hg2 either combines with the hemolysin or closes the pores,hence inhibiting its further hemolytic reaction. The toxin probably has no specific membrane receptor in the red blood cell membrane.     

Characterization of the Hemolytic Properties of an Extract from Phaeocystis globosa Scherffel

Phaeocystis globosa Scherffel, an organism that causes harmful algal blooms, is a genus of the family Prymnesiophyta (or Haptophyta) with eurythermal and euryhaline characteristics. P. globosa has been confirmed to produce hemolytic substances, which are a mixture of liposaccharides. In the present study, the hemolytic properties of extract of P. globosa are analyzed further. The effects of temperature, pH,different divalent cations, and membrane lipids on extract-induced hemolysis are discussed, as is the possible hemolytic mechanism. The results of the present study showed that the hemolytic activity of the extract was approximately 127.1 hemolytic units (HU)/L. The hemolytic reaction became fastest and a 50% decrease in absorbance was induced at 30 min at 37℃, and at pH 7.0; Hg^2 was the strongest inhibitor of the hemolysis compared with the other divalent cations and many membrane lipids, except for phosphatidic acid, inhibited the hemolytic activity to different degrees. These results suggest that the toxin may make pores in the surface of red blood cells and that Hg^2 either combines with the hemolysin or closes the pores,hence inhibiting its further hemolytic reaction. The toxin probably has no specific membrane receptor in the red blood cell membrane.     

二氧化氯对球形棕囊藻的抑制和杀灭作用

以海洋赤潮生物-球形棕囊藻汕头株(Phaeocystis globosa,ST strain)为材料,研究了ClO2对不同起始藻密度的棕囊藻的抑制和杀灭作用．结果表明,ClO2对球形棕囊藻有明显的抑制和杀灭作用．藻密度为2．35×10^9cells·L-1时,高于0．74×10-2mmol·L-1的ClO2对棕囊藻生长有一定的抑制作用。高于2．96×10-2mmol·L-1的ClO2对棕囊藻具有显著的杀灭作用．藻密度与ClO2浓度之间存在一定的剂量关系．藻密度为2．35×10^9、1．18×10^9、4．70×10^8、1．18×10^8 cells·L-1时。其96h的有效杀藻浓度分别为2．96×10^-2、2．22×10^-2、1．48×10^-2和0．59×10^-2mmol·L^-1．藻密度越高。杀灭单位藻细胞所需ClO2的浓度越低．ClO2作为杀藻剂在赤潮治理中具有很好的应用前景．     

球形棕囊藻游离单细胞的密度与囊体形成的关系研究

球形棕囊藻(Phaeocystis globosa Scherffel)主要以囊体形态形成赤潮,由单细胞向囊体形态的转变是赤潮爆发的关键。本研究推测囊体形成的前提是游离单细胞达到一定密度阈值,当密度低于该阈值时,囊体无法形成。基于此,本文探究了不同条件(温度、营养充气搅动、摄食压力、初始密度)下囊体形成时游离单细胞的密度。结果显示:不同培养条件下,囊体形成所需的游离单细胞密度不一致,但都达到了104cells/mL的数量级;稀释试验表明,利用f/2培养基稀释使游离单细胞的密度小于104cells/mL时,囊体不能形成,而密度大于104cells/mL的游离单细胞对照组,在24 h内便有囊体形成。总的来说,游离单细胞在高密度情况下更容易形成囊体。     

充气和搅动对球形棕囊藻生长及囊体形成的影响

球形棕囊藻生活史中包含游离单细胞和球形囊体两种生活形态,但是实验室中培养的球形棕囊藻经常无法形成囊体。研究通过向培养基中泵入过滤空气,以及给培养基提供不同程度的搅动,研究了充气和搅动对球形棕囊藻生长及囊体形成的影响。充气和搅动均显著提高了囊体的数量,并且提高了囊体内细胞的生长速率。但是充气对于囊体直径及囊体内细胞密度并无显著影响。搅动则明显的提高了囊体直径和囊体内细胞数量。然而,尽管充气以及搅动有利于球形棕囊藻囊体的形成,但是培养的囊体直径依然小于自然海区中囊体的大小。     

红树植物木榄有机溶剂提取物对球形棕囊藻的抑制效应

基于化感作用原理,利用有机溶剂对红树植物木榄(Bruguiera gymnorrhiza)叶片中的活性物质进行连续提取分离,分别得到正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相提取物。利用这些提取物进行抑藻实验,通过测定球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)的细胞密度发现:四种组分提取物对球形棕囊藻均具有显著的化感抑制作用;正己烷相和乙酸乙酯相提取物对球形棕囊藻的抑制效果明显优于正丁醇相和水相提取物的抑制效果。正己烷相提取物和乙酸乙酯相提取物对球形棕囊藻的48hEC₅₀分别为14.90mg/L和12.18mg/L。研究表明,藻细胞初始接种密度影响提取物的抑藻效应,低接种密度时抑制率极高,而随着接种密度的升高抑制率下降;接种密度极高时,提取物不但不会抑制甚至还会促进藻细胞的生长。     

球形棕囊藻对五种水生动物的急性毒性作用

利用室内半静水法研究球形棕囊藻培养液、藻细胞悬浮液、去藻细胞滤液、藻细胞内容物、藻细胞碎片以及溶血毒素粗提物对卤虫(Artemia sinica)、褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)、蒙古裸腹潘(Moina mongolia)、赤点石斑鱼幼鱼(Epinephelus akaara)和南美白对虾(Penaeus vannamei)5种水生动物的影响,并对其致毒途径进行分析.结果表明,与对照相比,培养液、藻细胞悬浮液处理卤虫,其运动速度下降,培养液、藻细胞悬浮液与毒素粗提物处理轮虫72 h,存活率显著降低(P＜0.05),卤虫、轮虫消化道中充满藻细胞,提示摄食球形棕囊藻可能是引起卤虫、轮虫中毒的主要途径.培养液、滤液和藻细胞内容物对赤点石斑鱼幼鱼均有显著的致死作用,而藻细胞碎片和溶血毒素粗提物对幼鱼的存活无明显影响,表明球形棕囊藻细胞表面并不存在毒性物质,球形棕囊藻可能会分泌有毒物质进入水体,进而影响鱼类的生长.培养液、藻细胞悬浮液、去藻细胞滤液、毒素粗提物处理蒙古裸腹溞72 h虽有死亡,但存活率与对照无显著差异;南美白对虾的情况与蒙古裸腹溞类似,表明球形棕囊藻及相关组分对蒙古裸腹溞和对虾的影响较小.这些结果表明,球形棕囊藻对不同生物的毒害作用不同;摄食和分泌有毒、有害物是球形棕囊藻引致生物中毒的主要途径;除了溶血毒素以外,球形棕囊藻还可能产生其他鱼毒性物质.