人EGFR显性负性突变体对胃癌细胞在裸鼠体内成瘤性及淋巴结转移的影响

为了研究人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative mutant of EGFR,dnEGFR)对胃癌细胞体内成瘤及淋巴结转移的影响,用目的质粒pEGFPN1-dnEGFR,空质粒载体pEGFP-N1分别转染胃癌细胞NCI-N87.筛选出稳定转染株,实验共分3组:NCI-N87细胞未转染组(untreated NCI-N87,UN组),NCI-N87细胞pEGFP-N1转染组(EN组);NCI-N87细胞pEGFPN1-dnEGFR转染组(DN组).将3组细胞接种于裸鼠右后足垫,6周后测量移植瘤大小及对应腹股沟转移淋巴结数目,HE染色验证,real-time PCR和Western印迹检测3组细胞中AKT1、MAPK3 mRNA和蛋白的表达改变.结果发现,DN组移植瘤较UN、EN组明显缩小(P0.05),且右腹股沟转移淋巴结数目较UN、EN组减少(P0.05).DN组细胞中,AKT1、MAPK3 mRNA和蛋白水平较UN、EN组降低(P0.05).提示pEGFPN1-dnEGFR可抑制裸鼠体内胃癌细胞成瘤及淋巴结转移,AKT1及MAPK3信号通路可能参与其中.     

人EGFR显性负性突变体负调控内源性EGFR功能的机制分析

通过定向克隆法构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR,脂质体介导下转染体外培养的SGC-7901细胞,应用Western blotting检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,激光共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测;并经RT-PCR、Western blotting检测DNEGFR-EGFP对内源性EGFRmRNA水平、蛋白及磷酸化水平的影响.成功检测到DNEGFR-EGFP蛋白的表达,DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜,DNEGFR-EGFP能降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平,而对内源性EGFRmRNA水平及蛋白水平无影响.研究证明DNEGFR通过降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平负调控EGFR功能,为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤生物治疗中的进一步研究打下基础.     

人EGFR显性负性突变体抑制胃癌细胞促血管形成能力

目的探讨人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR))对胃癌细胞促血管形成能力的影响及其分子机制,并检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法选用2株人胃癌细胞,分为如下6组:SGC-7901及NCI-N87细胞未转染组(US组,UN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组,EN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组,DN组)。采用人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC)管腔结构形成实验检测体外促血管形成能力,采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平,建立人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型,标本微血管密度(microvessel density,MVD)检测体内促血管形成能力,标本体积检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现HUVEC管腔结构形成抑制,培养液中VEGF水平降低,MVD计数降低,裸鼠皮下移植瘤体积变小。结论 DNEGFR可能通过下调VEGF分泌抑制胃癌细胞体外及裸鼠体内促血管形成能力,最终抑制裸鼠皮下移植瘤生长。     

显性负性突变体对AP2α转录因子及其活性的影响

转录蛋白2α(activator protein-2α,AP2α)的转录活性可能是全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)神经分化的关键调控点,但具体机制尚不清楚,显性负性突变是研究基因功能的一个经典手段.以携带AP2α全长基因的pAd-AP2α质粒为模板,分别扩增缺失bHLH及缺失TAD区域的AP2α片段,采用AdEasy腺病毒包装系统获得两种AP2α缺失型显性负性突变体重组腺病毒Ad-dnAP2α-△bHLH及Ad-dnAP2α-△TAD,腺病毒感染ATRA诱导24 h的大鼠MSCs可观察到60%以上RFP阳性细胞.Real-time-PCR、Western blot及免疫荧光结果显示AP2α定位于MSCs细胞核,经A-TRA诱导24 h,AP2α的表达无变化,而其下游基因bcl-2及c-kit表达增高,两种缺失型显性负性突变体腺病毒感染MSCs对野生型AP2α的mRNA及蛋白表达没有影响,却能有效抑制AP2α对下游靶基因bcl-2和c-kit的转录激活作用.为进一步研究AP2α转录活性在ATRA...     

没食子酸对PI3K/AKT基因表达的影响及其对胃癌细胞的抗转移作用

为了调查在蔬菜中大量存在的酚酸(没食子酸(GA),咖啡酸(CA)和原儿茶酸(PCA))对胃腺癌(AGS)细胞转移的抑制作用,本研究在不同浓度的CA、PCA或GA中培养了AGS细胞24 h或48 h来检测AGS细胞活性对NF-κB、IκB、PI3K、AKT和小细胞GTPase表达和对细胞骨架F-肌动蛋白模式的影响。本研究发现,0.01 mmol/L GA诱导的细胞毒性与4.0 mmol/L PCA相同。GA对AGS细胞迁移有明显的抑制作用。AGS细胞的MMP-2/9表达被2.0μmol/L GA所抑制。GA对MMP-2/9的抑制作用有可能包括抑制NF-κB活性。多蛋白参与转移和细胞骨架重组信号通路,包括Ras、Cdc42、Rac1、RhoA、RhoB、PI3K和p38MAPK,也被GA所抑制。此外,细胞骨架F-肌动蛋白的免疫反应检测显示GA处理的显著抑制作用。本研究表明,GA有可能成为一种有效的预防和治疗胃癌转移的药物。     

TGIF 对胃癌细胞生长和转移的影响

TGIF (TG-interacting factor) 是 TGF- β信号传导通路的抑制分子, 而 TGF-β早期抑制肿瘤生长,晚期促进肿瘤浸润与转移,但 TGIF 在肿瘤发生中的作用尚不清楚 . 将 TGIF 基因稳定转染胃癌细胞株 SGC-7901 ,采用 MTT 法、平板克隆形成试验、流式细胞术和裸鼠成瘤试验探讨 TGIF 对胃癌细胞生物学行为的影响,通过免疫组织化学分析裸鼠瘤组织基质金属蛋白酶 (matrix metallo proteinases, MMP) MMP2 、 MMP9 和血管内皮生长因子 (vascular eudothelial growth factor, VEGF) 的表达,通过 ELISA 和明胶酶谱试验分别分析 TGIF 转染细胞上清液中 VEGF 和活性 MMP2 与 MMP9 的含量变化 . TGIF 对 SGC-7901 细胞的生长、细胞周期分布和克隆形成率无影响 . TGIF 转染细胞接种裸鼠后无癌栓形成,但对照组有癌栓形成,且其瘤组织 MMP9 和 VEGF 的表达明显低于对照组,但 MMP2 在 3 组间的表达无差别 . TGIF 基因转染细胞、 PcDNA3.1 转染细胞和 SGC-7901 细胞上清液中 VEGF 的浓度分别为 (635 ± 20.3) ng/L 、 (780±25.4) ng/L 和 (791±23.9) ng/L , TGIF 转染细胞 VEGF 的含量明显低于对照组细胞 (P <0.01) , TGIF 转染细胞上清液中活性 MMP9 的含量明显低于对照组 . 尽管 TGIF 能部分拮抗 TGF-β1 介导的生长抑制和细胞周期阻滞作用,但它并不能使胃癌细胞的生物学行为恶化,相反 TGIF 通过下调 VEGF 和 MMP9 的表达降低胃癌细胞的浸润与转移能力 .     

ErbB3和ErbB4特异性配体筛选系统的建立及neuregulin-1突变体的筛选

Neuregulin-1(NRG1,纽兰格林)通过活化ErbB2/ErbB4二聚体具有治疗心衰的作用,目前已完成临床二期。为避免作为心衰治疗药物时同时激活ErbB3并产生副作用,因此用NRG1变异体的方法寻找能对ErbB4专一性激活的配体。文章构建了带有不同筛选标记的ErbB2、ErbB3、ErbB4细胞表达质粒,将ErbB2/ErbB3、ErbB2/ErbB4质粒共转染至CHO细胞,建立了ErbB2/ErbB3特异性表达和ErbB2/ErbB4特异性表达的细胞株。通过与新生大鼠原代心肌细胞比较,证明ErbB2/ErbB4细胞株信号传导功能与心肌细胞相似,NRG1可以激活下游的AKT信号途径、PI3K信号途径,并表现出良好的剂量效应。因此可以通过检测与心肌功能密切相关的下游信号AKT磷酸化水平快速筛选抗心衰药物,并通过与ErbB2/ErbB3信号激活水平比较鉴定其对心肌细胞的特异性。文章还构建了31个不同的NRG1突变体并在大肠杆菌中成功的表达和纯化。将这些突变体用于刺激两个细胞株,通过检测AKT磷酸化水平,发现这些突变体对ErbB2/ErbB3与ErbB2/ErbB4受体的激活能力不同。进一步检测其中5个ErbB2/ErbB4激活特异性发生改变的突变体与两对受体的亲和力,发现这些突变体和ErbB2/ErbB4与ErbB2/ErbB3受体亲和力的变化有一致性。最终筛选到了4个可以更特异性激活ErbB2/ErbB4受体的突变体作为更有效治疗心衰的候选药物。     

表皮生长因子对人二倍体成纤维细胞p21~(WAF-1)基因表达的双向性影响

p2 1 WAF-1又称 sdi- 1 ,是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 ( CDK)的抑制物基因 ,与细胞增殖调控及细胞衰老密切相关 .本研究为了解正常细胞中 p2 1 WAF-1对生长因子的反应性 ,以及其在细胞衰老时的表现 .我们以不同代龄的人胚肺二倍体成纤维细胞 ( 2 BS细胞株 )为实验对象 ,通过 Northern杂交术 ,观察表皮生长因子 ( EGF)对年轻 (低代龄 )细胞与衰老 (高代龄 )细胞 p2 1 WAF-1基因表达的影响 .结果显示 :p2 1 WAF-1在衰老 2 BS细胞中高表达 .EGF对年轻细胞 p2 1 WAF-1的表达有诱导作用 ,对衰老细胞有轻微诱导作用 ,在刺激后 3h左右达高峰 ,3～ 6h逐渐回落 ,并持续下降 .作用后 1 2h,其表达水平反而远低于作用前 .此作用在年轻细胞较为明显 .由此可见 :( 1 ) EGF对人二倍体成纤维细胞 p2 1 WAF-1的表达有双向性影响 ,先是一过性诱导 ,随后转为阻抑 ;( 2 )衰老细胞 p2 1 WAF-1对EGF的反应性有所降低     

Notch 家族四个蛋白质在人胰腺癌细胞 HPAC 中对 YY1 和 EGFR水平的影响

Notch信号通路是肿瘤形成过程中一种重要的信号通路,其中心分子为Notch受体. Notch受体为细胞膜上的单次跨膜蛋白,介导细胞间信号转导,哺乳动物细胞内包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的4个成员. Notch家族4个蛋白质在结构和功能上存在差异.前期研究显示,Notch1信号通路与转录因子YY1（YING-YANG 1）、表皮生长因子受体（EGFR）间存在调控作用. 本研究在人胰腺癌细胞HPAC中,采用RNA干扰技术,分别降低细胞中Notch家族4个蛋白质的表达,检测YY1和EGFR在mRNA和蛋白质水平上的表达;并构建相应的激活形式的Notch受体--Notch胞内结构域（Notch intracellular domain,NICD）真核表达质粒,在HPAC细胞中分别过表达4种NICD,检测其对YY1和EGFR表达水平的影响. 结果显示,降低细胞中Notch1或Notch3的表达,均使HPAC细胞中EGFR mRNA和蛋白质水平升高（P<0.05）,而降低Notch2和Notch4后,EGFR mRNA和蛋白质水平没有改变（P>0.05）.分别降低4个Notch的表达,对YY1的蛋白质和mRNA表达水平均没有改变（P>0.05）. 在HPAC细胞中过表达N1ICD和N3ICD后,YY1和EGFR的蛋白质水平降低（P<0.05）,而过表达N2ICD和N4ICD后,YY1和EGFR蛋白质水平没有改变（P>0.05）.分别过表达4种NICD均没有改变YY1和EGFR的mRNA表达水平（P>0.05）.初步得出结论是,在HPAC细胞中,Notch信号通路经Notch1和Notch3影响EGFR的表达. Notch1和Notch3对EGFR的表达可能具有负调控作用. 在Notch1和Notch3过度激活时,这种调控作用通过YY1介导. 本文可为深入研究Notch信号通路对胰腺癌发生发展的作用机制提供有意义的参考.     

Sprouty-2对胃癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的影响

目的:研究Sprouty2(SPRY2)基因在胃癌肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)和侵袭转移的影响。方法:体外培养人胃癌细胞(BGC-823),采用慢病毒介导的sh RNA沉默SPRY2基因,并用实时定量PCR与Western blot检测其SPRY2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的表达,采用细胞划痕实验、Transwell实验检测SPRY2基因沉默后的胃癌细胞侵袭转移能力变化。结果:在慢病毒介导sh RNA沉默SPRY2基因的人胃癌BGC-823细胞中,SPRY2的m RNA和蛋白表达明显降低(P0.05),SPRY2沉默后人胃癌细胞E-cadherin的蛋白表达增多(P0.05),vimentin的蛋白表达减少(P0.05)。此外,SPRY2沉默后,胃癌细胞迁移能力和侵袭能力明显减弱(P值均P0.05)。结论:Sprouty-2基因通过调节E-cadherin与vimentin的表达参与胃癌细胞的上皮-间质转化,进而促进胃癌细胞的迁移与侵袭。     

Cyclin D1 Serves as a Poor Prognostic Biomarker in Stage I Gastric Cancer

TNM stage still serves as the best prognostic marker in gastric cancer (GC). The next step is to find prognostic biomarkers that detect subgroups with different prognoses in the same TNM stage. In this study, the expression levels of epidermal growth factor receptor (EGFR) and cyclin D1 were assessed in 96 tissue samples, including non-tumorous tissue, adenoma, and carcinoma. Then, the prognostic impact of EGFR and cyclin D1 was retrospectively investigated in 316 patients who underwent R0 resection for GC. EGFR positivity increased as gastric tissue became malignant, and cyclin D1 positivity was increased in all the tumorous tissues. However, there was no survival difference caused by the EGFR positivity, while the cyclin D1-postive group had worse overall survival (OS) than the cyclin D1-negative group in stage I GC (10-year survival rate (10-YSR): 62.8% vs. 86.5%, p = 0.010). In subgroup analyses for the propensity score-matched (PSM) cohort, there were also significant differences in the OS according to the cyclin D1 positivity in stage I GC but not in stage II and III GC. Upon multivariate analysis, cyclin D1 positivity was an independent prognostic factor in stage I GC. In conclusion, cyclin D1 may be a useful biomarker for predicting prognosis in stage I GC.     

肿瘤淋巴管入侵与无淋巴结转移膀胱癌复发及预后的相关性分析

目的:分析肿瘤淋巴管入侵与无淋巴结转移膀胱癌复发和预后之间的关系。方法:选取临床资料完整的膀胱癌病例72例,分为淋巴结转移组(32例)和无淋巴结转移组(40例)。采用Spearman相关分析探讨淋巴管入侵与膀胱癌复发和预后的相关性,应用Kaplan-Meier法描绘生存曲线,Cox比例危险度模型筛选影响膀胱癌患者预后的因素。结果:在72例膀胱癌组织中,淋巴管入侵的阳性率是48.6%(35/72),淋巴管入侵的阳性率随肿瘤分期和分级增加而显著升高(P0.05);淋巴结转移组的淋巴管入侵阳性率为68.8%(22/32),显著高于无淋巴结转移的32.5%(13/40)。淋巴管入侵与膀胱癌的临床分期、分级、淋巴结转移以及无淋巴结转移膀胱癌复发均显著相关(P0.05)。淋巴管入侵阴性的患者的五年总体生存率显著高于淋巴管入侵阳性者,淋巴管入侵是无淋巴结转移膀胱癌复发和预后不良的危险因素。结论:肿瘤淋巴管入侵与膀胱癌临床分期和淋巴结转移密切相关,并影响膀胱癌患者的总体生存率,可作为无淋巴结转移膀胱癌复发和预后的预测因素。     

miRNA影响胃癌转移的机制

转移是恶性肿瘤基本的生物学特征,胃癌转移是导致胃癌患者死亡的主要原因. 诸多研究表明,微小RNA在胃癌转移过程中起着重要作用. 本文总结了有关抑制和促进胃癌转移微小RNA的研究新进展,并从影响信号传导途径、调控癌基因和抑癌基因表达、作用于细胞因子等方面分析了其主要作用机制.     

Isoliquiritigenin Induces Apoptosis and Inhibits Xenograft Tumor Growth of Human Lung Cancer Cells by Targeting Both Wild Type and L858R/T790M Mutant EGFR

Non-small-cell lung cancer (NSCLC) is associated with diverse genetic alterations including mutation of epidermal growth factor receptor (EGFR). Isoliquiritigenin (ILQ), a chalcone derivative, possesses anticancer activities. In the present study, we investigated the effects of ILQ on the growth of tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sensitive and -resistant NSCLC cells and elucidated its underlying mechanisms. Treatment with ILQ inhibited growth and induced apoptosis in both TKI-sensitive and -resistant NSCLC cells. ILQ-induced apoptosis was associated with the cleavage of caspase-3 and poly-(ADP-ribose)-polymerase, increased expression of Bim, and reduced expression of Bcl-2. In vitro kinase assay results revealed that ILQ inhibited the catalytic activity of both wild type and double mutant (L858R/T790M) EGFR. Treatment with ILQ inhibited the anchorage-independent growth of NIH3T3 cells stably transfected with either wild type or double-mutant EGFR with or without EGF stimulation. ILQ also reduced the phosphorylation of Akt and ERK1/2 in both TKI-sensitive and -resistant NSCLC cells, and attenuated the kinase activity of Akt1 and ERK2 in vitro. ILQ directly interacted with both wild type and double-mutant EGFR in an ATP-competitive manner. A docking model study showed that ILQ formed two hydrogen bonds (Glu-762 and Met-793) with wild type EGFR and three hydrogen bonds (Lys-745, Met-793, and Asp-855) with mutant EGFR. ILQ attenuated the xenograft tumor growth of H1975 cells, which was associated with decreased expression of Ki-67 and diminished phosphorylation of Akt and ERK1/2. Taken together, ILQ suppresses NSCLC cell growth by directly targeting wild type or mutant EGFR.     

Profiling of Phospho-AKT,Phospho-mTOR,Phospho-MAPK and EGFR in Non-small Cell Lung Cancer

Activation of numerous pathways has been documented in non-small cell lung cancer (NSCLC). Epidermal growth factor receptor (EGFR) has emerged as a common therapeutic target. The mitogen-activated protein kinase (MAPK) and AKT signaling pathways are downstream of EGFR and deregulated via genetic and epigenetic mechanisms in many human cancers. We evaluated selected markers in the EGFR pathway with reference to outcome. Tissues from 220 cases of NSCLC patients presented in a tissue microarray were assayed with immunohistochemistry for phosphorylated AKT, phosphorylated MAPK, phosphorylated mTOR, and EGFR and then quantified by automated image analysis. Individually, the biomarkers did not predict. Combined as ratios, p-mTOR/p-AKT, and p-MAPK/EGFR function as prognostic markers of survival (p=0.008 and p=0.029, respectively), however, no significance was found after adjustment (p=0.221, p=0.103). The sum of these ratios demonstrates a stronger correlation with survival (p<0.001) and remained statistically significant after adjustment (p=0.026). The algebraic combination of biomarkers offer the capacity to understand factors that predict outcome better than current approaches of evaluating biomarkers individually or in pairs. Our results show the sum of p-mTOR/p-AKT and p-MAPK/EGFR is a potential predictive marker of survival in NSCLC patients.     

下调UCA1通过靶向miR-23b及其下游靶基因抑制胃癌细胞的增殖和转移

摘要 目的：探讨长链非编码RNA尿路上皮癌相关基因1（UCA1）调控胃癌细胞增殖和转移的分子机制。方法：将人胃癌细胞株SGC7901分为：对照组、siRNA-NC组、siRNA-UCA1组、inhibitor-NC组和miR-inhibitor组、si-UCA1+inhibitor-NC组和si-UCA1+miR-inhibitor组。对SGC7901细胞分别转染siRNA-UCA1及阴性对照（siRNA-NC）、miR-inhibitor及阴性对照（inhibitor-NC）,未转染的细胞作为对照组。通过RT-qPCR检测细胞中UCA1和miR-23b-3p的水平。通过CCK-8法、伤口愈合实验和Transwell实验评价细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过Western blot分析细胞中IL6R、BCL2和HSP90B1蛋白的表达。使用pcDNA-UCA1/pcDNA-NC与pGL3-miR-23b-3p-WT/pGL3-miR-23b-3p-Mut共转染细胞,通过双荧光素酶报告实验验证UCA1与miR-23b-3p的靶向关系。结果：细胞培养48 h和72 h后,与对照组比较,siRNA-UCA1组的细胞活力分别降低了31.58%和31.40%（P<0.05）。与对照组比较,siRNA-UCA1组的细胞迁移率[(61.46±5.43)% vs (23.16±3.17)%]、侵袭细胞数量（109.17±9.66 vs 50.83±6.96）、IL6R、BCL2和HSP90B1的蛋白相对表达量均显著降低,而miR-23b-3p相对表达量升高（P<0.05）。与pGL3-miR-23b-3p-WT共转染后,与pcDNA-NC组比较,pcDNA-UCA1组的相对荧光酶活性降低了66.12%（P<0.05）。与si-UCA1+inhibitor-NC组比较,si-UCA1+miR-inhibitor组的细胞活力、细胞迁移率、侵袭细胞数量、IL6R、BCL2和HSP90B1的蛋白相对表达量均显著升高（P<0.05）。结论：下调UCA1通过靶向miR-23b-3p及其下游基因IL6R、BCL2和HSP90B1来抑制胃癌细胞的增殖和转移。     

腺病毒介导的EMC6基因通过下调FAK信号通路抑制胃癌细胞迁移

内质网膜蛋白复合物亚单位6（endoplasmic reticulum membrane protein complex subunit 6,EMC6）,也称穿膜蛋白93 (transmembrane protein 93, TMEM93)是我们首次报道的一个人类自噬相关分子。EMC6基因进化保守,表达广泛,在胃癌组织中表达下调或缺失。本研究利用构建的重组腺病毒5型EMC6（Ad5-EMC6）载体,感染胃癌细胞系BGC823和SGC7901,分析了其在肿瘤细胞的表达以及抗肿瘤活性。研究证明, Ad5-EMC6能够显著抑制胃癌细胞的克隆形成、细胞划痕修复、以及迁移和侵袭的能力。进一步的研究提示,Ad5-EMC6能够降低胃癌细胞局部黏着斑激酶（FAK）的Y576/577磷酸化水平,FAK下游的基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的蛋白质水平也同时下调。在裸鼠的腹膜扩散模型中,Ad5-EMC6处理组的小鼠腹膜结节数量明显减少或缺失。这些研究数据提示, Ad5-EMC6介导的FAK信号灭活可能是其抑瘤活性的机制之一,其分子机制还需要进一步探讨。