基于PARMS技术的结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB分子标记的开发

文中旨在建立结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的荧光分子标记,为分子药物敏感性试验提供简便、可靠的基因分型检测方法。对比分析利福平耐药菌株rpoB基因531、526、516、511、513等氨基酸位点的基因突变与敏感菌株中等位基因的序列差异,结合PARMS技术 (Penta-primer amplification refractory mutation system),建立rpoB基因的荧光分子标记。利用其对104例结核分枝杆菌临床分离株进行检测,经Sanger测序验证,正确率100%。并采用比例法药敏试验对这104份样本进行了利福平耐药性鉴定,与分子标记结果相符率为94.23%。结果表明,分子标记有较强可靠性,能检出表型药敏无法测出的低浓度耐药样本 (511/533单位点突变)。建立的11组荧光分子标记能覆盖92%–96%的利福平耐药菌株rpoB基因突变类型,为快速检测结核分枝杆菌利福平耐药提供新思路。     

结核分枝杆菌eis基因突变与氨基糖苷耐药的研究

目的：探讨结核分枝杆菌eis基因突变与氨基糖苷耐药之间的相互关系。方法：以本室保存的35株已确定耐一线药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素）的结核分支杆菌为研究对象,应用BECTEC960测定其二线药物（阿米卡星、卡那霉素）的耐药情况,同时应用基因测序的方法测定结核分枝杆菌eis基因突变情况,分析eis基因突变与氨基糖苷耐药之间的相互关系。结果：氨基糖苷耐药的部分结核分杆杆菌中,eis基因487位碱基出现突变,相应的163位氨基酸密码子由CGT突变为CAT,即由缬氨酸变为异亮氨酸。结论：eis基因V163I突变（缬氨酸变为异亮氨酸）可能与结核分枝杆菌耐氨基糖苷类药物有关。     

结核分枝杆菌eis 基因突变与氨基糖苷耐药的研究

目的:探讨结核分枝杆菌eis基因突变与氨基糖苷耐药之间的相互关系。方法:以本室保存的35株已确定耐一线药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素)的结核分支杆菌为研究对象,应用BECTEC960测定其二线药物(阿米卡星、卡那霉素)的耐药情况,同时应用基因测序的方法测定结核分枝杆菌eis基因突变情况,分析eis基因突变与氨基糖苷耐药之间的相互关系。结果:氨基糖苷耐药的部分结核分杆杆菌中,eis基因487位碱基出现突变,相应的163位氨基酸密码子由CGT突变为CAT,即由缬氨酸变为异亮氨酸。结论:eis基因V163I突变(缬氨酸变为异亮氨酸)可能与结核分枝杆菌耐氨基糖苷类药物有关。     

应用专一性寡核苷酸微阵列可靠地检测结核分枝杆菌利福平耐药性

DNA微阵列代表聚合酶链反应产物诊断测序的发展方向 .根据结核分枝杆菌rpoB基因利福平抗药性决定区域内点突变及其它重排的特征 .研制一种快速地鉴定结核分枝杆菌利福平耐药菌株的中等密度微阵列方法 .利福平抗药性通过使荧光标记扩增遗传物质与微阵列杂交测定 .检测5 3株利福平耐药结核分枝杆菌和 15株利福平敏感结核分枝杆菌 .微阵列方法的检测结果与药物敏感性试验和DNA测序结果完全一致 .临床标本PCR扩增后仅 1 5h可检出利福平耐药临床分离株 .表明寡核苷酸微阵列是高效的、专一性的方法 ,可作为检测利福平抗药性的快速方法以弥补传统培养方法的不足     

深圳地区结核分枝杆菌耐利福平株rpoB基因突变分布

目的:调查深圳地区结核分枝杆菌耐利福平(RFP)株rpoB基因突变的分布情况,建立结核分枝杆菌耐药基因快速检测的方法.方法:对55株结核分枝杆菌临床分离株的rpoB基因280个碱基(包括其核心区75个碱基)应用PCR-直接测序法(PCR-DS)测定序列,其中耐利福平株51株,敏感株4株.结果:4株敏感株无突变,92.2%(47/51)耐利福平临床分离株存在rpoB基因突变.基因突变导致531位氨基酸突变率为41.2%(21/51);导致526位氨基酸突变率为29.4%(15/51);导致516位氨基酸突变率为13.7%(7/51).联合突变发生率为2.0%(1/51).未检测到发生缺失或插入碱基突变的菌株.结论:深圳地区结核分枝杆菌耐利福平株发生rpoB基因突变最常见的是531位丝氨酸、526位组氨酸和516位天冬氨酸的基因突变,三者突变率之和为84.3%(43/51).PCR-DS方法可快速测定结核分枝杆菌RFP耐药基因突变.     

广泛耐药结核分枝杆菌耐药机制及其疾病诊断的研究进展

自20世纪90年代以来,全球结核病疫情回升,结核分枝杆菌耐药是其中的一个重要原因.广泛耐药结核病是指在耐多药结核病(即同时对异烟肼和利福平耐药的结核分枝杆菌引起的结核病)的基础上,还对氟喹诺酮类药物和至少3种二线静脉用抗结核药物(卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星)中的1种耐药的结核分枝杆菌引起的结核病.我国是结核病高流行国...     

新疆南疆MTB临床分离株异烟肼耐药情况及耐药相关基因的突变研究

目的:探索新疆南疆部分地区维吾尔族结核病人群中分离到的结核分枝杆菌基因组中的katG、inhA、kasA、ahpC基因突变与耐异烟肼的关联,揭示新疆肺结核病高患病率、高死亡率的可能原因.方法:收集新疆南疆部分地区维吾尔族结核病患者痰液标本,对MTB进行分离培养后,应用比例法检测其对异烟肼耐药性,运用PCR技术对所分离菌株的上述基因相关片段扩增并进行测序及序列分析.结果:筛选出实验菌株99株,其中敏感株63株,耐异烟肼菌株36株,耐药率为36.4%.耐药株中katG基因突变率为63.9%,315位点突变,突变类型AGC→ACC(Ser→Thr)、AGC→AAC(Ser→Asn);inhA基因突变率为47.2%,有缺失、同义突变和错义突变;kasA基因突变率为41.7%,突变类型为缺失和错义突变;ahpC基因突变率为8.3%,属于错义突变.结论:新疆南疆结核病高患病率、高死亡率的可能原因之一是结核分枝杆菌对INH产生了耐药,结核分枝杆菌对INH耐药机制可能与耐药菌株基因组内katG、inhA、kasA和ahpC基因发生了突变有关.     

PCR-SSCP检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变

目的 建立聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术快速检测结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药相关基因rpoB突变.方法 设计结核分枝杆菌RFP耐药相关rpoB基因PCR引物,建立PCR-SSCP技术检测临床菌株rpoB基因的突变导致的运动变位,同时采用PCR直接测序(PCR-DS)技术检测rpoB基因突变,并对上述方法检测结果进行分析和比较.结果 84株临床菌株均含有rpoB基因;PCR-SSCP和PCR-DS检测结果显示,56株RFP敏感菌株中rpoB基因分别有3株和2株检测出突变,检测特异性分别为94.6％ (53/56)和96.4％(54/56);28株RFP耐药菌株中rpoB基因分别有27株和28株发生突变,检测灵敏度分别为96.4％和100％.结论 本研究建立的PCR-SSCP技术能快速、简便、特异、敏感地检测结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变,具有临床应用前景.     

空洞型肺结核组织样本耐药菌及相关基因检测的临床研究

目的:比较分析空洞型肺结*核组织样本与痰样本结核分枝杆菌培养的阳性率及检测的一致性,并基于rpoB基因及KatG基因突变检测在诊断耐多药结核分枝杆菌中的重要作用,探讨直接应用肺结核组织样本进行结核分枝杆菌耐药性检测的临床意义.方法:对肺结核实施肺部手术患者,在术前和术后分别进行痰及手术切除组织样本利用BacT ALERT 3D快速培养系统进行分枝杆菌培养,对培养阳性者进行菌种鉴定,对结核分枝杆菌分离株应用绝对浓度法进行异烟肼(H)、利福平(R)药物敏感性测定,比较分析二者的一致性;同时应用特异性引物对手术切除组织样本直接进行分枝杆菌rpoB、KatG基因扩增,并与其培养结果进行比较.结果:62例进入分析的病例中,术前痰培养阳性22例,阳性率35.5%(22/62),药敏试验耐药18例,耐异烟肼16例,耐利福平13例.二者均耐药12例,术中所取结核组织培养阳性34例,阳性率55%(34/62),耐药30例,耐H26例,耐R20例,二者均耐药17例,术中所取结核组织耐药基因检测与INH耐药性相关的KatG基因突变表现有22例,与RFP的耐药性相关的rpoB基因突变18例.二者同时有突变表现的16例.所有培养为结核敏感菌的组织检测中,无上述二基因突变表现.在相关的rpoB基因突变18例病例中有16例同时表现出KatG基因突(89%,16/18).结论:厚壁空洞肺结核患者肺部手术切除组织样本病原学检测与痰样本间具有较好的一致性,且结核菌培养的阳性率明显高于普通痰培养.同时可直接应用组织样本进行结核分枝杆菌rpoB基因、KatG基因检测,可更加及时、准确地用于指导临床术后抗结核的药物治疗.     

2014年大连市结核病耐药监测结果分析

摘要：目的 全面了解大连市耐药结核病流行现状和特点，为有效控制耐药结核病提供依据。方法 收集2014年度初治、复治涂阳病例，对成功分离的448例结核分枝杆菌菌株，采用比例法对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、左氧氟沙星、阿米卡星、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺、卷曲霉素9种药物进行药物敏感试验，采用SPSS 12.0进行统计学分析，对耐药率的比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果 分离的448株菌株总体耐药率为26.8%，初治耐药率22.2%，获得性耐药率37.2%，耐多药率为6.9%，初始耐多药率5.5%，获得性耐多药率10.2%。结论 大连市结核病耐药发生率较高，但呈下降趋势。     

小鼠结核分枝杆菌耐药模型的建立与评价

目的 建立小鼠结核分枝杆菌耐利福平株静脉感染小鼠模型.方法 30只BALB/c雌性小鼠经尾静脉感染结核分枝杆菌耐利福平株每只106 CFU,观察小鼠一般状况,并分别在感染后6周、10周、14周处死小鼠,进行脾、肺组织病理切片、抗酸染色、计脏器荷菌数.结果 感染后小鼠体重呈逐渐上升趋势,脏器病理变化随时间推移由急性炎症逐...     

不同表型的结核分枝杆菌诱导U937细胞凋亡率差异分析

目的利用流式细胞技术检测耐多药结核分枝杆菌(Multidrug resistant mycobacterium tuberculosis,MDRTB)临床分离株和结核分枝杆菌一、二线药物敏感株分别感染U937细胞后的凋亡率及其时相性变化。方法用两组细菌分别感染U937细胞,在感染后2、4、8及12 h用流式细胞技术检测各组感染U937细胞的凋亡率,并分析其时相性变化。结果结核分枝杆菌MDR株和敏感株均能诱导U937细胞凋亡,两组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P0.01),MDR株诱导U937细胞凋亡率显著低于敏感株诱导的凋亡率,且在诱导后2、4、8及12 h各时间点的凋亡率都显著低于敏感株组,诱导早期凋亡率升高显著,特别是诱导后2 h凋亡率升高最显著,4 h以后凋亡率升高逐渐变慢。结论结核分枝杆菌临床分离株感染U937细胞后能快速诱导其凋亡,凋亡率与诱导菌株的耐药表型相关,敏感株诱导的凋亡率显著高于MDR株,诱导早期凋亡率升高最显著,4 h以后凋亡率升高减慢。     

高分辨率熔解曲线分析技术检测结核分枝杆菌的耐药性

目的:探讨高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting,HRM)技术检测结核分枝杆菌耐药突变位点的可行性。方法:对218株结核分枝杆菌进行利福平(RFP)和异烟肼(INH)的药物敏感性测定,并进行耐药基因位点的PCR扩增和测序,同时采用HRM方法检测RFP和INH耐药基因位点情况,分析HRM的敏感性和特异性。结果:218株结核分枝杆菌药敏试验结果显示,有106株(48.6%)对RFP耐药,100株(45.9%)对INH耐药,81株(37.4%)对RFP和INH均耐药。测序发现,101株(46.3%)存在RFP耐药基因的突变,107株(49.1%)存在INH耐药基因的突变。HRM检测结果显示,100株(45.9%)存在RFP耐药基因的突变,103株(47.2%)存在INH耐药基因的突变。分别以药敏试验和测序结果为标准,HRM检测RFP耐药的敏感性为94.3%(100/106)和99.0%(100/101);特异性为97.3%(109/112)和100%(117/117);INH耐药的敏感性为97.0%(97/100)和98.1%(103/105);特异性为97.3%(109/112)和100%(113/113)。结论:HRM快速检测结核分枝杆菌耐药具有较高的特异性和灵敏度,能够满足临床需求。     

MprAB双组分系统基因在耐药MTB中的表达水平分析

目的:分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株对4种一线抗结核药物的耐药情况以及结核分枝杆菌双组份系统Mpr AB与MTB耐药性的相关性。方法:收集本地区确诊的结核病患者痰液标本,分离培养得到的MTB菌株进行4种一线抗结核药物异烟肼(Isoniazid,H)、利福平(Rifampicin,R)、链霉素(Streptomycin,S)和乙胺丁醇(Ethambutol,E)的耐药性检测并比较双组分系统Mpr AB编码基因(Mpr A、Mpr B)在MTB标准株(H37Rv)、耐异烟肼(H-MTB)、耐利福平(R-MTB)、耐链霉素(S-MTB)、耐乙胺丁醇(E-MTB)和耐多药(Multi-drug Resistant MTB,M-MTB)菌株中的表达量。结果:分离培养得到72株分枝杆菌,对一种抗结核药物具有耐药性的有19株(H 8株、S 5株、R 3株、E 3株),耐药率为26.39%,对二种及以上耐药的有6株,耐多药率为8.33%(6/72)。Mpr A在H37Rv、H-MTB、R-MTB、S-MTB、E-MTB、M-MTB各组相对表达量分别为:1.12±0.07、3.34±0.42、4.16±0.46、3.09±0.24、2.27±0.18、8.43±0.63,Mpr B在各组相对表达量分别为:5.71±0.59、2.42±0.22、1.47±0.11、2.28±0.23、2.09±0.15、0.54±0.03。Mpr A和Mpr B基因在H37Rv与各耐药组之间比较差异有统计学意义(p0.05),Mpr A和Mpr B基因在各单耐药组与MDR组之间比较有统计学意义,而Mpr A和Mpr B基因在各单耐药组间比较均无统计学意义。结论:Mpr AB双组分系统与MTB耐药性的产生有一定的相关性。     

耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型的研究进展

潜伏结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)复发是新发结核病的主要来源,其中耐药结核病所占比例较大,使耐药LTBI复发的防控成为结核病研究的重点。耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型是开展耐药结核病防控相关机制研究、抗耐药结核分枝杆菌药物和疫苗研究的基础。目前耐药结核分枝杆菌感染动物模型缺乏,而已有的结核分枝杆菌标准株H37Rv潜伏-复发感染模型存在缺陷,如小鼠模型的潜伏期荷菌量偏高、复发期变异大,而猴模型的潜伏期和复发期不可预测。模型的可控性差使其应用困难,且缺乏可用的免疫学评价指标,导致远期复发无法预测。因此,基于现有H37Rv潜伏-复发感染动物模型的制备方法,展望耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型可能存在的缺陷,通过选用新的抑菌剂和诱导剂,制备有稳定潜伏期、潜伏时长适中、复发起点和复发水平变异小的动物模型,是未来耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型研究的方向。     

痰涂片标本用于结核分枝杆菌耐药性检测的研究

目的 研究抗酸染色结核分枝杆菌(简称结核杆菌)阳性痰涂片标本直接用于耐药性检测的方法。方法 对18株临床分离培养的结核杆菌用利福平进行药敏试验。分别提取菌株DNA和与之对应的痰涂片标本的菌体DNA,用聚合酶链反应(PcR)扩增ropB基因后进行固相杂交和核酸测序检测结核杆菌的耐药性。结果 18株结核杆菌中有12株对利福平耐药。经PCR扩增的ropB片段与探针杂交后,敏感菌株未发现rpoB基因的突变,自耐药菌株提取的DNA中rpoB突变体的检出率为100％(12／12),痰涂片提取DNA的检出率为91．7％(11／12)。所有耐药菌株DNA与痰涂片DNA核酸测序结果相吻合,都有rpoB基因核心区域碱基突变。结论 抗酸染色痰涂片阳性标本可直接用于检测结核杆菌利福平耐药基因rpoB突变体,是一种值得临床实验室推广使用的耐药菌诊断方法。     

GenoType MTBDRplus在内蒙古地区耐多药结核菌检测中的应用评价

从2001年WHO/IUATLD全球抗结核药物耐药监测之内蒙古耐药监测结核菌1 114株中,选取经比例法药敏结果得到的耐多药(MDR)结核菌188株,利用Geno Type MTBDRplus方法检测该批菌株的RIF、INH耐药情况及其耐药基因突变形式。最终得到MDR菌株103(54.79%)株,单耐RIF菌株52(27.66%)株,单耐INH菌株10(5.32%)株,全敏感菌株20株,TUB条带缺失1株,kat G质控带缺失2株。RIF耐药菌株检测的是rpo B基因区,该基因突变菌株有155株;rpo B S531L突变菌株为49.68%(77/155)。INH耐药菌株检测的是kat G基因区和inh A基因启动子区,共113株,其中kat G基因突变菌株占79.65%(90/113),主要是S3-15T1突变;inh A基因突变菌株占22.12%(25/113)。因此,Geno Type MTBDRplus可用于内蒙古地区MDR结核菌的快速检测。其中rpo BS531L突变形式在RIF耐药菌株中最常见;在INH耐药菌株中,kat G基因突变较inh A基因突变常见,S315T1突变是INH耐药菌中常见的突变形式。     

结核分枝杆菌Rv2629基因产物的亚细胞定位和穿梭质粒转化耻垢分枝杆菌

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药相关蛋白Rv2629在细胞内的亚定位及其与药敏的相关性。 方法 采用差速离心进行细胞组分分离及Western-blot检测初步判定蛋白亚细胞定位;采用pMV261转化耻垢分枝杆菌,BACT MGIT960测定转化菌株的利福平耐受性。结果 Rv2629蛋白主要定位于结核分枝杆菌的细胞壁和细胞膜,重组有Rv2629 突变位点191C质粒的耻垢分枝杆菌对利福平的MIC为160mg/L,相应的携带有野生型基因191A的宿主菌MIC为20mg/L。结论 Rv2629基因191A/C突变同利福平耐药相关。     

结核分枝杆菌GroEL1蛋白过表达的生理效应分析

为研究结核分枝杆菌热休克蛋白GroEL1在耻垢分枝杆菌中过表达所引发的生理效应,本实验采用透射电子显微镜观察细菌个体形态,并绘制细菌群体生长曲线;药敏试验检测重组耻垢分枝杆菌的药物耐受性;细菌攻毒BALB/c小鼠以检测细菌在体内的存活能力;通过病理切片观察细菌毒力。结果显示,GroEL过表达细菌菌体内核糖体数量显著增加,细菌生长分裂能力及群体适应能力提高,但对常用的一线、二线抗结核药物耐受性无影响。GroEL1过表达有助于延长细菌在宿主体内的生存周期,增强细菌毒力。结果提示,结核分枝杆菌GroEL1蛋白过表达会对细菌体内、体外生长产生明显影响。     

快速方法检测结核分枝杆菌耐药基因突变

快速准确地鉴定结核分枝杆菌与结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变的快速检测,对结核病人的诊断与治疗具有重要指导意义。本次根据结核分枝杆菌标准株H37RV序列,利用覆盖rpoB、katG、inhA基因突变区的系列寡核苷酸探针,并检测临床样品中结核分枝杆菌的基因突变情况,以此来判断耐药结果,并对其进行方法学评价。