呼吸道病毒感染核酸检测技术及其应用进展

急性呼吸道感染是全球范围内人类疾病和死亡的主要原因之一,其绝大部分是由呼吸道病毒所引起的。建立切实有效的实验室诊断技术,对于呼吸道病毒的防御和控制至关重要。以核酸为检测目的的分子诊断法,因其快速、简便、高通量、高灵敏度及高特异性,成为新一代呼吸道病毒检测的金标准。简要综述了呼吸道病毒感染核酸检测技术及其应用进展。     

呼吸道病毒多病原检测技术研究进展

呼吸道病毒感染是导致人群发病和死亡的主要原因之一。通过多重病原检测迅速筛查大量致病原,已成为呼吸道病毒感染检测的重要技术。本文介绍了呼吸道病毒多病原检测技术及一些对呼吸道病毒检测有潜在应用价值的新兴技术。这些技术包括多重呼吸道病毒快速分离培养技术、传统多重逆转录PCR技术、多重实时定量PCR技术、微芯片技术、质谱技术及宏基因组技术等。这些技术的发展和应用,不但有助于提高呼吸道病毒感染的快速诊断和治疗,而且也将促进新型呼吸道病毒的发现。     

H1N1感染背景对H9N2感染家猪的免疫保护作用

为了探索H1N1病毒感染史对H9N2病毒感染家猪的影响,本研究采用H9N2病毒分别感染有/无H1N1病毒感染史的家猪,比较两组家猪鼻腔泄毒滴度及血清转阳情况。研究发现:与无感染背景的家猪相比,H1N1病毒预感染过的家猪在接种了H9N2病毒后未检测到呼吸道泄毒。尽管两组家猪都产生了H9N2抗体,但有H1N1感染史的家猪体内的H1N1抗体水平在H9N2接种后快速显著上升,这些H1N1抗体与H9N2病毒并无血清学交叉反应。本研究提示,在自然界中,H1N1病毒在猪群中的流行极有可能为H9N2病毒在猪中的感染及传播构筑了天然的屏障,从而延缓了H9N2禽流感病毒通过家猪这一宿主获得哺乳动物适应性的进程。     

艾本德公司捐赠PCR仪

近日．艾本德公司向上海市公共卫生临床中心捐赠一台荧光定量PCR仪。作为上海指定的防控甲型H1N1流感的定点医疗机构,上海市公共卫生临床中心应急检测和生物安全实验室凭借自身优势将承担甲型H1N1流感病毒的快速诊断,病毒分离鉴定等重要任务。根据WHO发布的甲型H1N1流感实验室检测指南以及国家疾病预防控制中心甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案,实时荧光PCR方法被用于快速有效检测新型H1N1流感病毒核酸．定量PCR仪成为不可或缺的实验设备。     

用SILAC技术研究感染H5N1禽流感病毒后A549肺癌细胞蛋白质组的表达变化

目的：鉴定高致病性H5N1禽流感病毒感染A549肺癌细胞后,细胞蛋白质组的表达变化,并鉴定特异分子通路的改变及其涉及的关键蛋白质分子。方法：利用稳定同位素标记氨基酸技术（SILAC）标记A549细胞,得到“重标”或“轻标”的A549细胞;“重标”细胞感染高致病性F15N1禽流感病毒24h后提取细胞总蛋白,与从未感染病毒的“轻标”细胞中提取的总蛋白等量混合,酶解肽段,经正交反相色谱分离后用质谱鉴定,对数据进行定性和定量分析。结果：共鉴定到3504个蛋白质,有定量信息的蛋白质为2469个,病毒感染后表达量升高的蛋白质为72个,表达量降低的蛋白质为66个,其中包括参与多个分子调控途径如RNA剪接体、干扰素诱导通路、泛素化通路、胰岛素通路等的蛋白质。结论：建立了利用SILAC技术研究宿主细胞一病毒相互作用的方法,发现了高致病性H5N1禽流感病毒感染宿主细胞相关的关键蛋白质,为探索H5N1病毒致病的分子机理提供了理论基础。     

一种新型H5N1禽流感病毒血凝素抗原快速检测试剂的建立

利用5株广谱特异性抗H5亚型血凝素单克隆抗体和酶联免疫渗滤技术成功地建立了一种适于现场检测H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的抗原快速检测试剂H5-HA(Ag)Dot-ELISA。该试剂对41株代表当前亚洲地区流行的各种遗传变异亚系H5N1禽流感病毒检测均为阳性,对多数毒株的分析灵敏度优于0.1个血凝滴度(HA titer),其中部分优于0.01个血凝滴度;比较该试剂与早期开发的同类ELISA试剂,发现前者对后者未能检出的H5N1新变异株检测均为阳性;利用该试剂和商品化Directigen Flu A(BD)试剂检测两株H5N1病毒株,提示前者灵敏度高于后者;该试剂对一株H5N1病毒的检测灵敏度与标准RT-PCR相当;该试剂对24株非H5亚型病毒检测均为阴性,显示出良好特异性。以上结果提示,此研究建立的H5N1病毒抗原快速检测试剂在H5禽流感现场检测上具有较好的应用前景。     

澳大利亚开发出无危害研究H5N1病毒技术

新华社2月12日消息：澳大利亚研究人员近日表示，他们开发出一种解开致命性禽流感病毒H5N1编码的技术。该技术将帮助病毒专家和药物研究人员在研究H5NI病毒某个重要表面蛋白质时，免受被病毒感染的危险。此外，新技术还能帮助人们快速验证禽流感和其他流感病毒。     

澳大利亚开发无危害研究H5N1病毒技术

澳大利亚昆士兰格里菲思大学糖体学研究所的马克·冯伊兹泰恩教授和香港大学马里克·培瑞斯教授领导的国际项目研究小组,合作开发出一种解开致命性禽流感病毒H5N1编码的技术。该技术将帮助病毒专家和药物研究人员在研究H5N1病毒某个重要表面蛋白质时,免受被病毒感染的危险。此外,新技术还能帮助人们快速验证禽流感和其他流感病毒。     

H7N9禽流感病毒与其他流感病毒对雪貂致病性与传播力的比较

目的针对2013年3月中国爆发的人感染H7N9禽流感病毒,在雪貂体内进行致病性及传播力的研究,并与甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒进行比较。方法对新发H7N9毒株、甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒感染雪貂后的临床症状、体征,呼吸道排毒情况,组织病理学变化等进行评价和比较,并对H7N9毒株在雪貂群体中的传播力进行研究。结果雪貂模型的临床症状、死亡率、病毒传播以及组织病理学分析显示:H7N9病毒的致病性低于H5N1,与2009年起源于北美的甲型H1N1流感病毒相当。新发H7N9禽流感病毒可以在雪貂的呼吸道、心脏、肝脏以及嗅球进行复制。值得注意的是H7N9禽流感可以通过飞沫在雪貂间进行低水平的传播,并且在传播过程中,病毒基因组内有多个位点的氨基酸发生了替换。结论 H7N9禽流感病毒对雪貂的致病性较H5N1禽流感病毒低,与甲型H1N1流感病毒对雪貂的致病性相当,H7N9禽流感病毒可在雪貂间进行传播。     

JNK/MAPK通路与H7N9禽流感病毒感染小鼠模型肺损伤的关系研究

H7N9流感病毒感染呼吸道的能力强,感染后的病死率较高。流感病毒感染的肺组织可发生明显的炎症反应、氧化应激反应及细胞凋亡,进而出现肺损伤。c-Jun-N端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)/丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是细胞内调节凋亡、炎症的重要通路,该通路在H7N9流感病毒感染后肺损伤中的作用仍有待阐明。为了研究JNK/MAPK通路与H7N9禽流感病毒感染小鼠模型肺损伤的关系,本研究将C57BL/6小鼠随机分为对照组、H7N9组、H7N9+SP组,后两组制备H7N9低致病性病毒感染模型,造模后H7N9+SP组给予JNK抑制剂SP600125腹腔注射、连续3d。比较三组小鼠肺组织的病毒拷贝数、形态学改变、细胞凋亡率、炎症细胞因子含量、信号通路分子及凋亡分子表达量。结果显示:与对照组比较,H7N9组大鼠肺组织中H7N9病毒的拷贝数、细胞凋亡率、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的含量、JNK的磷酸化水平、Bax、cleaved-caspase-3的表达量明显增加(P0.05),Bcl-2的表达量明显减少(P0.05),p38MAPK、ERK1/2的磷酸化水平无明显变化(P0.05);与H7N9组比较,H7N9+SP组大鼠肺组织中H7N9病毒的拷贝数无明显变化(P0.05),细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、JNK的磷酸化水平、Bax、cleaved-caspase-3的表达量明显减少(P0.05),Bcl-2的表达量明显增加(P0.05)。本研究揭示H7N9禽流感病毒感染小鼠的肺损伤部分由JNK/MAPK通路的激活所介导。     

人H7N9禽流感病毒与H1N1流感病毒感染小鼠病理学损伤的比较

目的比较分析H7N9病毒与H1N1病毒感染小鼠病理学损伤特点,初步探讨两种病毒感染致小鼠急性肺损伤的致病机制。方法 H7N9病毒与H1N1病毒分别感染小鼠,观察不同病毒感染后小鼠生存率,并于不同时间点取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠等组织,伊红-苏木素染色并进行组织病理学分析,免疫组化检测病毒抗原分布及中性粒细胞浸润。综合分析肺组织病理损伤与病毒复制、宿主免疫反应之间的关系。结果 H7N9病毒感染小鼠肺及脾脏损伤较轻,存活率较高。H1N1病毒感染的小鼠肺及脾脏损伤较重,感染后9 d全部死亡;两种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、少量间质细胞和肺泡上皮细胞,病毒复制水平无明显差异。但H1N1病毒感染后肺及脾脏中均有大量中性粒细胞浸润,小鼠机体炎症反应明显强于H7N9病毒感染后小鼠炎症反应。结论 H7N9病毒与H1N1病毒感染后小鼠病理学损伤特点及程度均不同,病毒复制是小鼠肺损伤的诱发因素但并非决定因素,宿主针对病毒感染产生的免疫反应程度与急性肺损伤密切相关。     

利用焦磷酸测序技术检测H7N9禽流感病毒NA基因分子标签

本研究旨在建立H7N9亚型禽流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法,用于H7N9型禽流感病毒的快速检测和鉴定。通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对,发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签。通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物,建立了H7N9型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法。基于NA基因特定缺失区域建立的焦磷酸测序技术能用于H7N9亚型禽流感病毒国内分离株NA基因的快速检测和鉴定,且具有较好的特异性和重复性。通过对3株H7N9亚型禽流感病毒分离株的检测,表明3株H7N9亚型禽流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签。本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒NA焦磷酸测序检测方法,可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定。     

人呼吸道禽流感病毒受体的分布趋势

禽类流感病毒和人类流感病毒具有很强的受体识别特异性,分别与唾液酸α-2,3Gal和α-2,6Gal受体分子结合而感染各自的宿主细胞．这种受体结合特异性是流感病毒在禽类和人类之间跨种属传递的主要障碍．应用凝集素组织化学染色技术,探讨人呼吸道各解剖学部位流感病毒唾液酸受体的分布特征．结果显示,唾液酸α-2,3Gal受体, 即禽类流感受体,主要分布在下呼吸道的呼吸部即呼吸细支气管和肺泡, 而在主气管、支气管和细支气管仅少量分布．相反,人类流感病毒受体,唾液酸α-2,6Gal受体在气管、支气管呈高密度分布,随着支气管分级逐渐降低分布减少,至肺泡分布最少．但比较人呼吸道发育成熟过程中,唾液酸α-2,3Gal和α-2,6Gal受体的表达,未发现明显差别．禽流感H5N1病毒体外感染人呼吸道组织试验结果表明,肺泡上皮较支气管和气管上皮易感染,与唾液酸α-2,3Gal受体分布特点相符合．结果提示,人呼吸道可被禽流感病毒感染,目前H5N1病毒极少发生人传人的特点,可能与个体间上呼吸道唾液酸α-2,3Gal受体表达差异有关．     

研究揭示H10N8禽流感病毒感染人的分子机制

继2013年先后在H5N1和H7N9禽流感病毒跨种间传播研究中取得重要进展后,中国科学院微生物研究所高福课题组在H10N8禽流感病毒感染人的分子机制和跨种间传播趋势评估上取得新的进展,研究结果已经于2015年1月9日在国际杂志《自然通信》(Nature Communications)在线发表。2013年12月起,我国先后发生3例人感染H10N8禽流感病毒病例,并导致2人死亡。这种能感染人的     

H7N9感染与神经细胞的血小板活化因子分泌浓度的相关性研究

H7N9病毒感染除引起患者呼吸道症状外,还可能导致中枢神级系统病症。血小板活化因子(Platelet activating factor,PAF)是一种生物活性磷脂,参与神经系统的部分功能。但尚未有研究讨论PAF是否参与H7N9病毒中枢神经系统疾病致病机制。本研究通过H7N9病毒体外感染小鼠小胶质细胞(BV2)和神经母瘤细胞(N2a)发现,H7N9流感病毒可以感染BV2、N2a细胞,引起细胞明显病变并使细胞活性下降;此外H7N9病毒感染BV2细胞后,PAF浓度水平明显上升,PAF乙酰水解酶(Platelet activating factor acetylhydrolase,PAF-AH)基因pafah1b1和pafah2表达水平明显下降。而N2a细胞染毒后PAF-AH基因表达水平明显上升,染毒48h后胞内PAF浓度明显下降。本研究首次将PAF与流感病毒性脑病联系在一起,提示PAF可能参与流感病毒性脑病的致病过程,可作为治疗的药物靶点进行后续研究。     

巨细胞病毒感染与SARI肺炎病例的相关性研究

探讨巨细胞病毒感染与住院严重急性呼吸道感染(SARI)肺炎的相关性.以67例符合严重急性呼吸系统感染临床诊断标准的住院病例为研究对象,同时以81例流感样门诊病例作为对照,使用荧光定量PCR方法检测所有研究对象的巨细胞病毒感染情况.采用二分类logistic回归模型分析巨细胞感染与住院严重急性呼吸道感染肺炎病例的关联.巨细胞病毒在呼吸道感染病例中有较高的阳性率,阳性率随年龄呈下降趋势.80％以上巨细胞病毒阳性病例存在与其他常见呼吸道病原共感染情况.Logistic回归分析表明:年龄和多病原共感染是SARI肺炎发生的危险因素,单独CMV阳性与SARI肺炎的发生没有显著相关性.SARI肺炎中CMV与其他呼吸道病原共感染概率高,临床上应加强对呼吸道感染病例的巨细胞病毒检测.     

植物病毒检测技术──组织印迹法

组织印迹法（Tissue blotting）是在酶联免疫吸附（Enzyme-Linked immunosorbent Assay ELISA）的基础上发展起来的植物病毒检测技术,该技术不仅保持了ＥＬＩＳＡ对病毒检测的灵敏度高,特异性强的特点,而且大大地简化了操作程序,对病毒的检测更加快速、简单、方便、印迹在硝酸纤维素膜上的样品能保存３个月以上,检测结果能直观地显示出病毒感染的部位。组织印迹技术尤其适用于植物病毒的大规模普查。     

荧光定量RT-PCR检测甲型H1N1病毒核酸的临床意义

目的观察荧光定量RT-PCR技术在检测甲型H1N1病毒核酸的临床意义。方法对135例经确诊为甲型H1N1的感染患者的咽式子采用荧光定量PCR技术检测H1N1病毒核酸,同时对40例健康体检者的咽式子做为对照组一同进行甲型H1N1病毒核酸检测。结果 135例确诊为甲型H1N1的患者经荧光定量PCR检测阳性129例,符合率为96.99%。40例健康体检者结果全阴性。结论荧光定量PCR检测甲型H1N1病毒核酸具有快速、特异性高等特点,在采用此方法诊断甲型H1N1时,阳性即可确诊,阴性者要结合临床。     

采用基因微阵列技术对常见呼吸道病毒进行检测的初步研究

建立一种高通量的基因微阵列检测技术,对常见呼吸道病毒感染进行监控.根据公开发表的8个病毒科38种常见呼吸道病毒的序列,计算其保守区域,设计病毒的特异性检测探针,制备呼吸道病毒检测基因微阵列.利用随机引物PCR方法标记样品中的病毒靶序列,标记产物与基因微阵列上的探针杂交,清洗、扫描后进行结果分析.采用流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒作为报告病毒,并对80例上呼吸道感染患者的咽拭子标本进行验证测试.初步结果表明,该呼吸道病毒微阵列基因芯片检测是可行的,在利用基因微阵列技术对病毒监控方面进行了有益的尝试,得到了有经验的信息.