Ssp dnaB蛋白质内含子介导的重组人脑钠素的制备

脑钠素(BNP)是临床治疗代偿失调性心衰竭的有效药物。将脑钠素与组氨酸标签(His-tag)以及具有自我剪切功能的Ssp dnaB微型蛋白质内含子进行融合表达。表达产物经Ni-Sepharose亲和层析及体外复性处理后,用CM_纤维素对复性产物进行了浓缩,并通过改变CM-纤维素柱内的pH及温度,诱导Ssp dnaB微型蛋白质内含子的剪切作用,使脑钠素从融合蛋白中释放并与载体蛋白(His-DnaB)分离,再经C4反相高效液相色谱法进一步纯化后,从每升培养液中获得了2.8mg纯度达97%的重组人脑钠素。体外活性测定结果表明,重组人脑钠素对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应,其EC50为1.94×10-6mg/mL。     

重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化的应用进展

重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色.亲和纯化作为最为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用.由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异.应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签.近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法.多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述.     

蜘蛛杀虫肽与Bt-toxin C肽融合蛋白(BGT)基因的原核表达与蛋白质纯化

从质粒pCAMBIA2301-BGT中获得蜘蛛杀虫肽与Bt-toxin C肽融合蛋白(BGT)基因编码区全长,并构建了原核表达载体pET28a-BGT。将此质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得有效表达,新蛋白的分子量约为51 kDa,主要以包涵体形式存在。在变性条件下以不同的咪唑和pH值洗脱方式进行比较,确定以咪唑为金属鳌合亲和柱层析的洗脱条件,获得了纯BGT蛋白。     

a-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的制备和鉴定(英文)

-鹅膏毒(环)肽和二羟鬼笔毒(环)肽是剧毒的鹅膏菌和其它几种致死毒菌中由一些修饰氨基酸组成的环肽毒素。由于-鹅膏毒肽对真核生物的mRNA合成的专一性抑制和和二羟鬼笔毒肽对肌动蛋白的专一性束缚,因而它们在分子生物学和细胞学研究中具有重要应用,对其需求逐步增加。为此,作者使用了一种改良的毒素提取方法,以制备高效液相色谱从灰花纹鹅膏菌中分离制备-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,并通过紫外吸收光谱和质谱进行鉴定,表明-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离效果好,纯度高。本方法对其它毒菌中的-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离制备具有同样的应用价值。     

连接肽对融合蛋白ELP[I]_(30)-linker-eGFP相变的影响

研究G4S和Poly N连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响.将编码两种不同连接肽G4S和Poly N的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因克隆到pET28-ELP[I]30表达载体中,在宿主菌E.coli BLR(DE3)中经IPTG诱导表达ELP[I]30-linker-eGFP,通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)及镍柱亲和层析纯化ELP[I]30-linker-eGFP蛋白.结果显示,成功构建、表达具有活性的两种连接肽的融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP,连接肽G4S使融合蛋白产生不可逆相变,而Poly N不影响融合蛋白可逆相变,该研究对类弹性蛋白标签的应用具有指导意义.     

泛肽系统的组成和功能(一) 一 系统组成 底物识别与蛋白质泛肽化

泛肽(Ubiquitin 简称Ub)是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的小蛋白质。泛肽依赖性的蛋白质降解途径(Ubiquitin-dependebt proteiytic pathway)是目前已知的最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径。泛肽系统由Ub、Ub活比酶、Ub结合酶、Ub-蛋白质连接酶、Ub-C末端水解酶和26S蛋白酶体组成。本文详细地介绍了泛肽系统各个组成部分的种类、结构与功能,蛋白质泛肽化及其降解机制和底物识别模式。     

泛肽系统的组成和功能(一)—系统组成、底物识别与蛋白质泛肽化

泛肽（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ,简称Ｕｂ）是一个由７６个氨基酸残基组成的非常保守的小蛋白质。泛肽依赖性的蛋白质降解途径（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ＿ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｐａｔｈｗａｙ）是目前已知的最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径。泛肽系统由Ｕｂ、Ｕｂ活化酶、Ｕｂ结合酶、Ｕｂ＿蛋白质连接酶、Ｕｂ＿Ｃ末端水解酶和２６Ｓ蛋白酶体组成。本文详细地介绍了泛肽系统各个组成部分的种类、结构与功能,蛋白质泛肽化及其降解机制和底物识别模式。     

一种特异性识别非小细胞肺癌A549细胞的小分子肽

应用"一个珠子一个化合物"的组合化学肽库,以期筛选得到特异性识别非小细胞肺癌细胞(A549)的小分子肽.初次筛选共得到29个与A549阳性结合的珠子,经氨基酸序列分析后发现含有-NGXG-肽链结构的序列共有10个.选择cNGQGEQc作进一步的细胞特异性研究,发现cNGQGEQc与非小细胞肺癌A549、Calu-1及H178的粘附特异性明显高于其他细胞系,对cNGQGEQc的结构分析显示,-NGXG-及六肽长度对小分子肽与A549细胞的粘附非常重要.标记FITC的小分子肽cNGQGEQc能与A549细胞发生特异性结合.用抗整合素的抗体(!1～6,"v和#1～5)阻断小分子肽与A549细胞表面的相应受体结合,结果显示,α3与$亚单位的任何组合均对cNGQGEQc与A549细胞的粘附有明显的阻断作用.结果表明,小分子肽cNGQGEQc是通过细胞表面整合素α3与非小细胞肺癌A549发生特异性结合.     

从基因工程小C肽人胰岛素原类似物（B－R2－A）制备人胰岛素

以融合蛋白的形式,在Ｅ．ｃｏｌｉ中经温度诱导表达了小Ｃ肽人胰岛素原类似物（Ｂ－Ｒ２－Ａ）．表达的融合蛋白可占细胞总蛋白６８％．经磺酸解,及初步分离Ｓ－磺酸型融合蛋白,再经ＣＮＢｒ裂解后,进行还原重组,ＨＰＬＣ分离纯化等步骤,每升发酵液可得到Ｂ－Ｒ２－Ａ约５０ｍｇ。经酶促转化及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５纯化,得重组人胰岛素约２０ｍｇ,其氨基酸组成与人胰岛素相同,并具有与猪胰岛素相同的生物活性．     

非核糖体肽合成酶(NRPSs)作用机理与应用的研究进展

许多微生物能利用非核糖体肽合成酶(NRPSs)合成结构复杂、种类繁多的的生物活性肽。非核糖体肽因其独特的理化特性和药理学特性已被广泛关注,极具商业开发潜力。NRPSs由多个模块组成,模块的不同空间排列顺序决定其多肽产物的氨基酸序列特异性。NRPSs以多载体巯基化模板机理进行多肽合成,其底物特异性由腺苷酰化结构域和缩合结构域共同实现。目前,人们已经利用天然的NRPSs、某些特定结构域、将已知NRPSs的模块或特定结构域进行组合甚至杂合组合而构建成的新的NRPSs来合成目的多肽。     

重组标签蛋白在蛋白质纯化中的研究进展

重组蛋白的表达纯化是研究蛋白质结构与功能的重要环节之一,表达重组蛋白宿主细胞的监测筛选和重组蛋白低水平可溶性表达、低回收率以及不稳定易水解等问题一直是蛋白质高通量纯化工艺中的难题。近年来,将多肽或蛋白质作为标签,与目标蛋白共表达的方法已经很大程度地解决了这一问题。因此,针对不同特性的蛋白质选择合适的标签纯化策略在重组蛋白纯化研究中是相当关键的环节。本文回顾了几种传统标签蛋白的研究概况(His-tag,Arg-tag,Flag-tag,GST-tag,MBP-tag等),着重对近年来新开发的了几种标签蛋白(Si-tag,Halo-tag,Intein-CBD-tag,ELPs-tag等)进行了深入探讨,并对新标签蛋白在蛋白质纯化中的应用前景作以展望。     

蛋白质剪切及其应用

蛋白质剪切是一种翻译后修饰事件 ,它将插入前体蛋白的中间的蛋白质肽段 (Intein ,internalproteinfrag ment)剪切出来 ,并用正常肽键将两侧蛋白质多肽链 (Extein ,flankingproteinfragments)连接起来。在此过程中不需要辅酶或辅助因子的作用 ,仅需四步分子内反应。Intein及其侧翼序列可以通过突变产生高度特异性的自我切割用于蛋白质纯化、蛋白质连接和蛋白质环化反应 ,在蛋白质工程方面有广泛的应用前景。     

Designing an ELP-intein system: toward a more realistic outlook

Abstract

Despite the ever-growing demand for proteins in pharmaceutical applications, downstream processing imposes many technical and economic limitations to recombinant technology. Elastin-like polypeptides tend to aggregate reversibly at a specific temperature. These biopolymers have been joined with self-cleaving inteins to develop a non-chromatographic platform for protein purification without the need for expensive enzymatic tag removal. Following the design and expression of an ELP-intein-tagged GFP, herein, we report certain complications and setbacks associated with this protein purification system, overlooked in previous studies. Based on our results, a recovery rate of 68% was achieved using inverse transition cycling. Fluorescence intensity analysis indicated a production yield of 11?mg GFP fusion protein per liter of bacterial culture. The low expression level is attributable to several factors, such as irreversible aggregation, slipped-strand mispairing or insufficiency of aminoacyl tRNAs during protein translation of the highly repetitive ELP tag. While the goals we set out to achieve were not entirely met, a number of useful tips could be gathered as a generic means for implementing ELP-intein protein purification. Overall, we believe that such reports help clarify the exact capacity of emerging techniques and build a fairly realistic prospect toward their application.     

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.     

重组GM—CSF／IL—3融合蛋白的纯化

重组粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素３（ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３）融合蛋白是一种很有发展潜力与应用前景的重组药物,它在大肠杆菌中是以饱含体形式表达的,针对这一重组蛋白饱含体的洗涤、变性、复性以及最终的纯化过程,进行了深入地研究,重点分析和比较了不同条件及因素对于重组蛋白包含体变性及复性过程听影响。实验结果表明,８ｍｏｌ／Ｌ尿素及１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ可以使包含体充分溶解。在复性过程中,采用     

重组人GM—CSF／MCAF融合蛋白的变性,复性及纯化研究

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和单核细胞趋化激活因子(MCAF)融合蛋白在大肠杆菌中高效表达后,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后,探索了rhGM-CSF/MCAF变性和复性的合适条件。复性后的样品经Sephadex G-75凝胶过滤和CM-Sepharose FF离子交换两步层析,得到了具有生物学活性的SDS-PAGE纯的rhGM-CSF/MCAF。Western blot检测表明,纯化的rhGM-CSF/MCAF能分别与GM-CSF和MCAF抗体发生特异反应。     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

A Rapid Method for Purification of Myelin Basic Protein

A rapid procedure for purification of myelin basic protein has been developed. White matter is delipidated with 2-butanol, and the residue is extracted at pH 7.5 and 8.5. Myelin basic protein is solubilized by extraction in acetate buffer, pH 4.5. The entire procedure requires less than 4 h, and gives homogeneous protein essentially free of protease activity. This procedure can be scaled down to process milligram amounts of white matter; thus it can be very useful for purification of myelin basic protein from very limited amounts of human white matter obtained during surgery.     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人重组IL6／IL2融合蛋白的变性、复性及纯化

经超声破碎,分离已表达CH925包涵体,较系统地研究变性剂浓度、融合蛋白浓度对蛋白折叠的影响.在还原型及氧化型谷胱甘肽复性条件下,成功地将融合蛋白CH925折叠成具有IL6及IL2双活性蛋白,IL6的比活为2.3×10⁸U/mg, IL2比活为2.2×10⁶U/mg.经阴离子交换、凝胶过滤层析,获得一定纯度的CH925,配合反相HPLC.洗脱收集蛋白峰,CH925纯度为98%.