重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的稳定性研究

研究重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)的稳定性.以抗病毒活性和纯度为主要检测指标,考察rHSA-IFNα-2b的热稳定性,酸碱稳定性以及冻融耐受性.rHSA-IFNα-2b在37℃、55℃下放置5h后生物学活性无明显降低,60℃水浴lh即可见活性降低了约40%;pH值(分别为2、3、9)改变时,生物学活性未发生明显变化;rHSA-IFNα-2b反复冻融后聚合体逐渐增加,冻融4次后聚合体含量达到17.91%,但生物学活性无明显降低.重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白对热、酸碱变化稳定,但不宜冻融.     

温度对不同年龄大鼠海马器官型脑片长期培养中细胞活性和tau蛋白表达的影响

探讨在海马器官型脑片的长期培养过程中,温度对不同年龄大鼠的海马脑片细胞活性和tau蛋白表达的影响,并以此为依据建立一种研究tau相关疾病的模型.选用出生后1周、2周、4周和8周的Wistar大鼠制备海马器官型脑片,培养温度分别为34℃和37℃,培养时间为21d,在培养过程中,检测培养基中的乳酸脱氢酶的含量以判断脑片的活性,采用免疫印迹技术检测细胞骨架蛋白tau的含量的变化.结果如下:(1)温度对海马脑片的细胞活性影响:34℃较37℃能在较长的时间内保持细胞活性,而在同一培养温度时,不同年龄鼠的脑片的细胞活性变化趋势一致;(2)温度对海马脑片的tau蛋白表达的影响:成年鼠(4周和8周)的海马脑片tau蛋白在34℃时能维持较长时间的稳定表达,而在37℃时tau的表达量随培养时间的延长而显著下降,且随鼠龄的增加,这种影响越明显.温度对1周和2周龄乳鼠的海马脑片tau蛋白的表达无影响.结论为:34℃培养条件下,4周和8周龄大鼠制备的海马器官型脑片能更长时间维持脑片的活性和tau蛋白的稳定表达,从而可望成为研究与tau蛋白相关疾病(如老年性痴呆)的理想模型.     

利用圆二色谱和流式细胞术分析干扰素-α的构象与其抗病毒活性的相关性

利用圆二色谱(Circular dichroism,CD)和流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分析干扰素(Interferon,IFN)-α的构象与其抗病毒活性之间的关系。以重组人IFN-α(rIFN-α2b和rIFN-α2a)为材料,变温CD谱分析表明,在65℃以下,两种IFN-α的二级结构相对稳定,当温度高于65℃以后,两者的二级结构发生不可逆的改变。FCM分析构象变化前后IFN-α的抗病毒活性发现,构象的改变一定程度上减弱了其抗病毒活性。rIFN-α2b和rIFN-α2a具有相似的变化趋势。以上结果表明,IFN-α的构象是影响其抗病毒活性的重要因素之一,同时也验证了CD结合FCM是分析蛋白质药物构象与其细胞水平上生物学活性相关性的较好组合。     

人lambda1和epsilon干扰素基因在WI-38细胞中的表达及其活性比较

研究新型干扰素hIFN-λ1和hIFN-ε基因在WI-38细胞中的表达及其生物学活性,并进行对比分析。构建His重组融合表达载体pcDNA3.1A-hIFN-λ1-His和pcDNA3.1A-hIFN-ε-His,脂质体法分别转染WI-38人胚肺细胞。采用微量细胞病变抑制试验研究和比较rhIFN-λ1-His和rhIFN-ε-His的抗病毒活性;MTT法检测其对肿瘤细胞生长的影响; RT-PCR相对定量法检测其诱导WI-38和SHG-44细胞产生人MxA抗病毒蛋白的活性。结果表明rhIFN-λ1-His抗病毒活性、抗肿瘤细胞增殖活性和诱导产生MxA蛋白活性要强于rhIFN-ε-His。hIFN-λ1和hIFN-ε干扰素的抗病毒效应的分子机理均与诱导细胞产生MxA抗病毒蛋白相关。为进一步探讨和比较hIFN-λ1和hIFN-ε的生物学活性及其作用机制奠定了一定的基础。     

体外构建组织工程化软骨的初步研究

观察用藻酸钠凝胶在体外长期培养软骨细胞的情况,为求进一步用藻酸钠凝胶在体外构建组织工程化软骨提供初步研究.将传代培养的、细胞终浓度为1×107/mL的软骨细胞复合藻酸钠凝胶,注入圆柱形模具中,将模具分别浸入100、200、300 mmol/L的固化剂氯化钙溶液中,固化15 min使其成形,于体外培养2、4、6周后,行HE染色、阿尔新蓝染色,了解软骨细胞的生长情况.2、4、6周时软骨细胞与藻酸钙凝胶复合良好并能在其中保持活性及分裂能力,且在6周时出现类软骨变化.因此藻酸钠凝胶是可用于体外构建组织工程化软骨的生物材料.     

东北白眉蝮蛇毒细胞毒组分的分离制备及活性鉴定

用离子交换层析和凝胶过滤法从东北白眉蝮蛇毒中分离出一种具有较强的细胞毒活性的蛋白质。这种蛋白质对肿瘤细胞的细胞毒作用元选择性,但各种肿瘤细胞的敏感性有一定差别。对正常人体细胞也有一定的细胞毒性作用,与肿瘤细胞相比,敏感性较低。这种蛋白质加热到56℃,30分钟,细胞毒活性稳定。4℃及-20℃保存4个月,细胞毒活性稳定。PH值低于4及高于9时,可使其完全失活。     

利用亮氨酸和赖氨酸设计新型α-螺旋抗菌肽

【目的】根据螺旋轮模型设计以亮氨酸(L)为疏水面,赖氨酸(K)为亲水面的新型α-螺旋抗菌肽LK,并对该抗菌肽的生物学活性进行检测。【方法】利用圆二色光谱分析LK的二级结构,同时,评价LK的抑菌活性、稳定性和细胞选择性。【结果】在模拟细胞膜的环境中LK呈α-螺旋型结构。LK对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有很强的抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)在2-4μmol/L之间。LK具有很强的酸碱盐稳定性。肽浓度为2-4μmol/L时,LK表现出较低的溶血活性和细胞毒性。【结论】根据螺旋轮模型结构,以疏水性的L和正电荷性的K设计的新型抗菌肽LK具有较高的细胞选择性及稳定性,具有替代抗生素的发展潜力。     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

研究重组人干扰素α2b栓剂的稳定性。方法将重组人干扰素α2b栓在不同温度下保存不同时间,分别检验干扰素生物学活性、溶出度试验、融变时限、pH和微生物限度及外观的稳定性。结果重组人干扰素α2b栓在4~8℃条件下放置当时和放置48个月后的IFN生物学活性基本一致,未见下降;在20~25℃条件下放置24个月后IFN生物学活性未见下降,放置32个月后活性下降32%,36个月后IFN生物学活性下降55%;37℃条件下放置4个月后IFN生物学活性未见下降。结论重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质的稳定性好。     

大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及其纯化保存策略

编码完整大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的基因被引入pET11c形成pET11-LT,该质粒在E.coli BL21(DE3)中得到较高效率的表达,约46mg/L。用D(+)Immobilized galactose柱可以在很宽的pH范围(pH7.3～10.4)内用多种方法对LT进行纯化且保持其结构完整。溶于TEAN(pH7.3)或碳酸盐缓冲液(pH10.4)的LT,冻干后保存于4℃,可长久保持其完整结构,此为保存LT的较好策略。与GM1结合实验、CHO细胞及Patentmouse毒性检测实验证明纯化的LT具有生物学活性。     

蛇毒L-氨基酸氧化酶的生物学作用

蛇毒(snake venom,SV)是天然的最丰富的蛋白(酶)源之一,而L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,LAAO)是SV的主要蛋白(酶)组成成份,也是SV重要的活性和毒性蛋白成份,其生物学活性多样。近年来的研究表明,SV-LAAOs具有明显的影响血小板聚集、诱导细胞凋亡、细胞毒性、抑菌活性及抗病毒/HIV活性等生物功能。本文简述了SV-LAAO的酶学和结构特性,综述了SV-LAAO以上生物学作用及其相关作用机制,以期为今后深入研究SV-LAAO提供参考。     

重组人干扰素α1 b滴眼液稳定性的研究

重组人干扰素α 1b滴眼液放置不同温度和不同时间后,定期测定其效价、无菌试验、pH值和外观,在4℃条件下,24个月内pH、无菌试验、外观和0月一致,没有明显变化;生物学活性24个月没有降低;室温（18～25℃）放置12个月活性明显降低,pH、无菌试验、外观和0月一致;37℃放置6个月活性基本丧失,pH、无菌试验、外观和0月一致.重组人干扰素α1b滴眼液在4℃条件下生物活性及其他理化性质稳定性较好.     

新型战伤急救止血剂体外细胞毒性研究

目的:研究新型战伤急救止血剂的体外细胞毒性,初步探讨其用于战伤急救止血时的生物安全性.方法:参照我国医疗器械生物学评价标准,选用小鼠L929细胞,应用MTT法、直接接触培养法、流式细胞检测细胞凋亡法、扫描电镜直接观察细胞生长状况等检测新型战伤急救止血剂的细胞毒性.结果:新型战伤急救止血剂细胞毒性为0-1级,符合我国医疗器械评价标准毒性分级标准,各浓度组与阴性对照组无差异,P＞0.05;L929细胞与沸石直接接触生长良好,流式细胞仪检测细胞凋亡率与阴性对照组无差异;扫描电镜观察在沸石表面生长良好.结论:复合新型战伤急救止血剂细胞相容性良好,符合我国医疗器械安全性评价标准,是一种安全、高效、多功能的战伤止血剂.     

猪脱细胞真皮基质与RV-23抗菌肽复合材料的制备及生物学特性初步研究

目的:制备低免疫原性猪脱细胞真皮基质(PADM)与抗菌肽RV-23的复合材料,并对其生物学特性进行初步评价。方法:将抗菌肽RV-23分别以1、5、20μmol/L的浓度加到直径6 mm、厚约1 mm的低免疫原性PADM上,制备复合材料;菌落计数分析实验检测复合材料的抗菌能力;溶血实验检测复合材料对红细胞膜的裂解能力;CCK-8实验检测复合材料对真核细胞的细胞毒性;Tricine-SDS-PAGE检验RV-23的稳定性。结果:制备了PADM与抗菌肽RV-23复合材料;活菌计数实验表明复合材料对大肠杆菌有很强的抗菌活性,并随着抗菌肽浓度的升高不断增强;溶血实验表明PADM能有效降低RV-23裂解红细胞膜的能力,增加血液相容性;CCK-8实验显示PADM能够有效降低RV-23的细胞毒性,复合材料对人表皮角化细胞HaCaT和小鼠成纤维细胞NIH-3T3几乎没有毒性;Tricine-SDSPAGE实验结果显示复合材料抗菌肽RV-23稳定性较好。结论:PADM/RV-23复合材料比较稳定,不仅具有较强的抗菌性,而且有良好的血液相容性和极低的细胞毒性,有望成为新型创伤修复材料。     

氨基酸定点突变提高灵芝蛋白LZ-8热稳定性的研究

通过氨基酸定点突变技术提高灵芝免疫调节蛋白LZ-8的热稳定性。通过分子动力学模拟结合温度因子预测对LZ-8氨基酸突变位点进行理性设计,在毕赤酵母X33菌株内构建并表达LZ-8突变体蛋白,采用HeLa细胞生长抑制实验和差示量热扫描分析检测并比较了LZ-8突变前后生物学活性及热力学参数。结果显示,LZ-8 N-端α螺旋为理论预测的温度敏感区域,在该区域进行F8W和R9K氨基酸双位点突变,突变后的LZ-8热稳定性提高,相变温度Tm上升0.92℃,相转变焓值ΔH提高23.14 kJ/mol,但突变后LZ-8生物学活性基本不变,LZ-8和LZ-8突变体对HeLa细胞生长抑制的IC50值分别是2.238μg/mL和2.407μg/mL。通过理性设计氨基酸突变位点,获得了稳定性提高但生物学活性不变的灵芝免疫调节蛋白LZ-8的突变体。     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

将重组人干扰素α2b栓剂在不同温度下保存不同时间,检验干扰素生物活性、溶出度试验、融变时限、pH值和微生物限度及外观的稳定性。重组人干扰素α2b栓剂在4~8℃条件下放置48个月;在20~25℃条件下放置24个月IFN生物活性未见下降,37℃放置4个月IFN生物活性未见下降。重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质有较好的稳定性。     

亚栖热菌透性化细胞的耦合固定化研究

将海藻酸盐凝胶包埋法与交联法和聚电解质静电自组装覆膜法相耦合,对含有海藻糖合酶活性的亚栖热菌的透性化细胞进行了固定化研究。结果表明,利用重氮树脂和聚苯乙烯磺酸钠对海藻酸凝胶微球交替覆膜,可以显著提高凝胶微球在磷酸盐缓冲液中的稳定性,以碳二亚胺对固定化细胞进行交联处理则可以提高固定化细胞中海藻糖合酶的热稳定性。透性化细胞经包埋－交联－覆膜耦合固定化后,酶活回收率为32％,最适酶反应pH值由6.5左右升至7.0左右,最适反应温度未变,仍为60℃。所得固定化细胞间歇反应时,催化麦芽糖转化为海藻糖的转化率可达60％,重复使用4次（每次50℃、反应24h）,酶活损失小于20％,转化率可保持在50％以上。     

碱性成纤维细胞生长因子制剂稳定性的研究

本研究通过MTT法检测bFGF的活性,研究了不同温度下四种制剂中bFGF的稳定性。结果得到,bFGF在2．0mol／L NaCl,0．05mol／L PB溶液(pH7.2)中,-20℃下贮藏6个月活性没有明显的下降;bFGF水剂贮藏在4℃下,bFGF活性随贮藏时间延长逐步下降,单位活性bFGF用量由0.4ng／mL下降为0．9ng／mL,室温下bFGF的活性丧失快于4℃下贮藏,3个月后bFGF单位活性用量由0．4ng／mL下降为1．0ng／mL。而乳霜剂和胶束剂中的bFGF在两种温度下贮藏一个月后,均检测不到对细胞生长的刺激作用。说明低温有利于制剂中bFGF的稳定,乳霜剂和胶束剂中的bFGF稳定性不好。     

重组人干扰素α-2b滴鼻剂的研制

重组人干扰素α-2b(rIFNα-2b)滴鼻剂的试制及临床前工作研究.进行了理化和生物学性质试验、稳定性试验、鼻腔局部刺激性试验、急性毒性试验、长期毒性试验和动物体内抗病毒试验等.本品连续三批工艺稳定,检定合格,性质稳定,2～8℃保存24个月后生物学活性无明显下降,使用安全,无不良反应.其它各项试验均符合现行<中国药典>的要求.表明该制剂具有比较好的开发与应用前景.     

枇杷4-香豆酸CoA连接酶的某些特性

以枇杷品种‘解放钟’果实为试材,用硫酸铵分级盐析方法提取4-香豆酸CoA连接酶,其最适温度为10和40℃,40和10℃下的热稳定性较好;最适pH为8．0且较稳定;最适底物为咖啡酸。     

连花清瘟颗粒等8种中药体外抗新型冠状病毒活性以及细胞毒性研究

为了评估连花清瘟颗粒等中药（Traditional Chinese Medicines,TCMs）体外的抗新型冠状病毒作用。采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测药物对Vero细胞的毒性,确定药物的细胞毒性。再以Vero细胞为模型,设置药物组、瑞德西韦对照组、病毒对照组,用新型冠状病毒感染细胞,药物作用48 h,提取核酸,用荧光定量PCR法检测新型冠状病毒RNA拷贝数,评估药物的抗病毒作用。细胞活性结果和病毒RNA拷贝数变化的结果显示,连花清瘟等8种药物中,连花清瘟抗新型冠状病毒活性较好,半数抑制浓度达到了0.43 mg/mL,药物六神丸和藿香正气水的细胞毒性较大,其他5种药物的抗新型冠状病毒活性较低。本研究揭示了莲花清瘟等8种药物体外的抗新型冠状病毒效果,为进一步的研究奠定了基础。