Bmi-1稳定干扰增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性

目的:观察Bmi-1稳定干扰后对乳腺癌细胞药敏性的影响.方法:构建Bmi-1 shRNA逆转录病毒表达载体,并用该逆转录病毒感染人乳腺癌细胞,建立Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞株.采用不同浓度的化疗药物5-氟尿嘧啶和顺铂处理上述细胞,MTT法观察乳腺癌细胞的生长抑制率.结果:免疫印迹检测结果表明Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞株成功建立.MTT检测显示Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞(MDA-MB-435S-Bmi-1/RNAi)增殖抑制率显著高于对照细胞(MDA-MB-435S-vector)(P<0.05),并且呈浓度依赖性.其中在MDA-MB-435S-vector中5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50值分别为1.7233 mg/L和2.9065 mg/L,而在MDA-MB-435S Bmi-1/RNAi稳定细胞株5-氟尿嘧啶和顺铂中的IC50值分别为0.9733 mg/L和1.8563mg/L(P<0.05).结论:Bmi-1在乳腺癌细胞对化疗药物敏感性中发挥重要作用,Bmi-1干扰能增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性.     

RNA干扰技术对PC12细胞CaMKⅡβ基因表达的影响

观察RNA干扰表达载体对PC12细胞中CaMKIIβ基因的抑制作用。构建针对CaMKIIβ基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot 检测其对CaMKIIβ mRNA及蛋白质水平的影响。构建的质粒表达载体在PC12细胞中抑制了CaMKIIβ mRNA及蛋白质的表达。与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对CaMKIIβ mRNA的抑制率48h、72h分别为46.40％、64.69％,蛋白抑制率72h约为74.77％。RNAi表达载体可以有效地抑制PC12细胞CaMKIIβ基因的表达。     

乳腺癌组织TGFβ1及其受体与 NF-κB表达的研究

目的研究转化生长因子(TGF)β1及其I型受体(TGFβRI)与核转录因子(NF)κB在乳腺癌组织中的蛋白表达及其与临床病理特征的关系.方法建立40例乳腺癌标本共120个微组织的组织芯片,应用免疫组织化学S-P法检测乳腺癌组织TGFβ1、TGFβRI与 NF-κB蛋白的表达情况.结果 TGFβ1、TGFβRI和NF-κB在乳腺癌中均有表达,三者过表达率分别为80%、65%和80%;TGFβ1的表达强度与TNM分期、组织学分级、腋淋巴结受累呈正相关(P<0.05,P<0.01和P<0.01),NFκB的表达强度与组织学分级、TNM分期呈正相关(P<0.05),TGFβRI的表达与分级、TNM分期、腋淋巴结受累均无明显相关性;TGFβ1和NF-κB的表达呈显著正相关(P<0.01).结论 TGFβ1和NF-κB的过表达与乳腺癌恶性及预后有密切关系, NF-κB可能在一定程度上受到TGFβ1的调控.     

BSP基因RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞生物学特性的影响

旨在研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)基因表达后对人乳腺癌细胞MDA-MB-231BO生物学特性的影响。应用pSilencer5.1-U6Retro构建针对BSP基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒,将重组质粒转染293细胞制备病毒悬液感染MDA-MB-231BO细胞,利用嘌呤霉素筛选抑制BSP表达的乳腺癌细胞。Western blotting检测细胞内BSP蛋白表达,采用MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示,成功构建BSP基因RNAi稳定转染的231BO-BSP27细胞。231BO-BSP27细胞内BSP蛋白表达抑制率为69.3%,与对照组细胞相比,231BO-BSP27细胞的生长速率和克隆形成率明显降低;S期细胞数量明显减少,G0/G1期细胞增多。由此证实,逆转录病毒介导的RNAi能实现BSP基因稳定沉默,从而抑制MDA-MB-231BO细胞的生长和增殖。     

靶向下调FOXM1 基因表达对乳腺癌MDA-MB-231 细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1 对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真 核转录载体pSilencer1.0-U6-FOXM1-shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基 偶氮唑盐(MTT) 比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量- 聚合酶链反应(Real-time qPCR)、蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测FOXM1 基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSilencer1. 0-U6-FOXM1-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P<0.05）,平板克隆形成显著减少（P<0.05）, 重组载体转染后显著抑制MDA-MB-231 细胞中FOXM1 基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXM1 基因对乳腺癌细胞 株MDA-MB-231 生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

RNA干扰对MDA-MB-231细胞中CaSR基因表达的影响

目的:运用RNA干扰技术,观察siRNA表达载体在乳腺癌细胞MDA-MB-231中对CaSR基因表达的影响。方法:构建靶向CaSR基因的RNA干扰表达载体,用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,运用Real-Time荧光定量PCR,Westernblot技术分别从mRNA以及蛋白表达水平检测CaSR基因表达的变化。结果:所构建的质粒载体成功的在MDA-MB-231细胞中抑制了CaSR mRNA及其蛋白的表达。与对照组相比,psiRNA-CaSR载体对CaSR mRNA的抑制率达到65%,对CaSR蛋白抑制率约为70%。结论:实验证明所设计的shRNA片段可以有效地抑制CaSR基因的表达,为下一步研究工作奠定了基础。     

靶向下调FOXM1基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真核转录载体pSilencer1．0-U6-FOXMI—shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量·聚合酶链反应（Real—timeqPCR）、蛋白免疫印迹法（Westemblot）分别检测FOXMl基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSileneerl．0-U6-FOXMl-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P〈0．05）,平板克隆形成显著减少（P〈0．05）,重组载体转染后显著抑制MDA—MB-231细胞中FOXM1基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXMI基因对乳腺癌细胞株MDA—MB-231生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

血管紧张素Ⅱ1型受体短发夹环RNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:RNA干扰(RNAi)是一种新的高效特异地阻断基因表达的基因阻断技术.本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)的短发夹环RNA质粒(pAT1R-shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响.方法:构建pAT1R-shRNA质粒,并转染入鼠VSMC中,应用RT-PCR及Western blot检测血管平滑肌细胞AT1R的mRNA和蛋白表达的变化,验证pAT1R-shRNA是否具有RNAi作用;应用台盼蓝染色法和MTT法检测VSMC增殖情况.结果:构建的质粒pAT1R-shRNA经测序鉴定验证与预期相符.转染组AT1R的mRNA和蛋白表达明显减少,与对照组相比有显著性差异(P＜0.01);转染质粒同时加AngⅡ刺激的VSMC增生明显受到抑制,与对照组相比有显著性差异(P＜0.01).结论:构建的pAT1R-shRNA质粒具有RNAi作用,并对AngⅡ所诱导的VSMC增殖有抑制作用.     

UL27、UL29基因shRNA表达载体的构建及对HSV-2的干扰效应研究

探讨Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)UL27、UL29基因联合靶向siRNA对HSV-2复制的影响。构建UL27、UL29基因的siRNA的重组表达载体并转染293细胞,通过实时荧光定量PCR技术和蛋白质印迹方法检测UL27、UL29基因的表达,终点滴定法检测细胞上清液中的各组病毒滴度,MTT法检测细胞的存活率。结果显示:(1)成功构建短发夹RNA(shRNA)重组表达载体。(2)转染后48 h,与空白组(空载体)相比,UL27 shRNA75组对UL27基因mRNA的抑制率为75.17%(P0.05),UL29 shRNA1461组对UL29基因mRNA抑制率为66.08%,具有显著性差异(P0.05)。UL27 shRNA75联合UL29 shRNA1461联合干扰组对UL27基因抑制率约为91.28%,UL29基因表达抑制率约为80.40%,与空白组比较具有显著性差异(P0.05)。(3)终点滴定法结果显示单干扰组和联合干扰组可不同程度降低上清液中的病毒感染滴度,与空白组比较差异性显著(P0.01)。(4)Western blot检测目的基因蛋白,单干扰组与联合干扰组可不同程度降低目的基因蛋白的表达,其中UL27shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组能显著抑制相应的蛋白表达水平,蛋白表达量明显减少,与单干扰组相比具有显著差异(P0.05)。(5)经MTT法检测,UL27 shRNA75、UL29 shRNA1461、UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组的细胞存活率明显提高,差异有显著意义(P0.05)。构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达载体,能在体外细胞水平上不同程度的干扰HSV-2 UL27、UL29基因表达,UL27、UL29联合干扰效率更高,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制。     

川芎嗪对转化生长因子β1刺激肝星状细胞CTGF及Ⅰ型胶原表达的影响

研究川芎嗪对大鼠肝星状细胞株(hepatic stellate cell-T6,HSC-T6)结缔组织生长因子CTGF(connective tissue growth factor)及Ⅰ型胶原表达的影响.培养HSC-T6细胞,不同浓度川芎嗪与转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激的HSC-T6共同孵育.用MTT(3-(4,5-Dimethyhhiazol-2-y1)-2,5-diphenyhetrazolium bromide)法检测HSC-T6增殖:免疫细胞化学法观察川芎嗪对CTGF表达的影响;Western印迹法检测CTGF蛋白的表达.EUSA(enzyme linked immunosorbent assay)法测定Ⅰ型胶原表达.结果表明,一定浓度(100、200、400、600 mg/L)川芎嗪能抑制HSC-T6增殖,且呈剂量依赖性.免疫细胞化学结果显示随着川芎嗪浓度的升高,CTGF表达依次递减,与正常对照组比较,具有显著性差异(t=4.216,P<0.01).川芎嗪还可以明显抑制CTGF蛋白的表达,并可抑制Ⅰ型胶原合成,二者抑制程度呈正相关关系(r=0.861,P<0.01).川芎嗪可能通过抑制HSC-T6细胞增殖,下调CTGF的表达,阻断Ⅰ型胶原合成,从而发挥其抗肝纤维化的作用.     

Hsa-miR-212靶向调控BRCA1对乳腺癌MDA-MB-231细胞放疗敏感性的影响

[目的]探讨Hsa-miR-212靶向调控BRCA1对乳腺癌MDA-MB-231细胞放疗敏感性的影响。[方法]设MDA-MB-231细胞组、RT组(X射线以12Gy/min的剂量率发射,照射孵育时间为48h)、Hsa-miR-212 mimics组、RT+Hsa-miR-212 mimics组,各组设6个平行样,培养72 h。试验结束后,采用细胞计数试剂盒-8和结晶紫测定增殖及单克隆形成数目,流式细胞仪测量细胞凋亡水平,RT-PCR法及蛋白印迹法测定Hsa-miR-212、BRCA1 mRNA和蛋白水平。[结果]与MDA-MB-231细胞组比较,RT组、RT+Hsa-miR-212 mimics组OD值、存活率、细胞克隆形成数目、Hsa-miR-212 mRNA、BRCA1 mRNA与蛋白、穿膜数均降低(P<0.05),Hsa-miR-212 mimics组OD值、存活率、细胞克隆形成数目、Hsa-miR-212 mRNA、BRCA1 mRNA与蛋白、穿膜数升高(P<0.05);与RT组比较,Hsa-miR-212 mimics组、RT+Hsa-miR-212 mimics...     

靶向VEGF小干扰RNA协同5-FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡机制的研究

探讨慢病毒介导的靶向VEGF小干扰RNA联合应用化疗药物5 FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制。以携带VEGF siRNA的慢病毒载体感染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组VEGF mRNA、VEGF蛋白及凋亡相关蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,慢病毒VEGF siRNA干扰组细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,凋亡相关蛋白P53及P21表达上调,而SIRT1、Bcl-2及Survivin表达下调。流式细胞术检测显示慢病毒干扰组及5-FU组细胞凋亡率显著升高,联合治疗组的协同作用更为明显。上述结果表明：慢病毒介导的RNA干扰能明显抑制MCF-7细胞VEGF的表达,通过下调SIRTI蛋白的表达,导致P53蛋白表达上调,并调控其下游P21、bcl-2和Survivin的表达,从而诱导MCF-7细胞的凋亡,并且提高了MCF-7对5-FU的敏感性。     

靶向干扰Chkl增强阿霉素抗人乳腺癌MCF-7/adr细胞的作用机制研究

Chkl的高表达可能是肿瘤对化疗药物的敏感性降低的重要因素之一,本研究的目的是观察siRNA干扰Chk1对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/adr(耐阿霉素)生长及细胞周期的影响,探讨Chk1在乳腺癌细胞耐药中的作用机制。采用RNAi技术抑制MCF-7/adr细胞中Chk1的表达。Westernblot检测转染前后细胞内Chk1蛋白表达情况,经阿霉素作用后,流式细胞术(FCM)检测其细胞周期分布及细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖。Western blot结果显示,Chk1 siRNA转染24h后,MCF-7/adr细胞中Chk1蛋白表达下降了67%,明显低于对照组和空载体转染组(P<0.05)。FCM法检测结果显示,同时,抑制Chk1的表达可解除阿霉素引起的G_2/M期阻滞;使阿霉素诱导的细胞凋亡率由转染前的(5.54±0.15)%上升到(22.24±0.13)%(P<0.05);在阿霉素浓度为0.4mg/L、4mg/L时,细胞的增殖活性分别下降13%、34%。提示siRNA干扰Chk1能够通过调控MCF-7/adr细胞周期及增殖从而增强乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性,为临床上克服乳腺癌化疗耐药提供了新的作用靶点。     

RNA干扰VEGF对体外JAR细胞生长的影响

利用pSUPER质粒作为载体,在人绒癌JAR细胞内成功的沉默了VEGF基因的表达,建立了稳定转染pSUPER—shVEGF1,pSUPER—shVEGF2干扰质粒的JAR细胞株．随后利用RT—PCR证实了在JAR细胞株中,VEGF基因的表达被抑制．显微观察及流式细胞学检测转染后细胞株克隆生长情况显示体外培养条件下VEGF基因受抑后JAR细胞生长周期无发生变化,提示VEGF在体外可能对JAR细胞增殖无直接作用．     

PES1基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞的生长抑制

目的:构建PES1基因的慢病毒干扰载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-30生长的影响。方法:设计针对PES1基因的siRNA引物,克隆到pSIH1-H1-Puro载体,包装成慢病毒,测定病毒的滴度,感染人乳腺癌细胞ZR75-30,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低PES1对ZR75-30细胞生长的影响。结果和结论:构建了具有明显干扰效果的PES1基因的siRNA慢病毒载体,能够有效抑制ZR75-30细胞内源的PES1 mRNA和蛋白水平,敲低PES1能够抑制ZR75-30细胞的生长。     

小干扰RNA靶向VEGF基因体内外抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖

 血管生成与肿瘤生长、侵袭、转移密切相关.血管内皮生长因子能特异地促进内皮细胞分裂、增殖及迁移,在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用.通过RNAi抑制VEGF表达的抗血管生成疗法可有效应用于肿瘤治疗.本研究采用化学修饰的siRNA在体内外抑制VEGF基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性.选用阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000作为转染试剂,将针对人VEGF基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人类乳腺细胞株MCF-7和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),蛋白印迹实验等检测siRNA治疗组和对照组VEGF基因表达及细胞增殖变化.体外实验结果显示：靶向VEGF基因siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,细胞生长抑制率达52.5%;VEGF的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.01）;裸鼠体内实验结果显示：siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RT-PCR结果同时表明治疗组VEGF表达下调.体内外对照组各指标无显著变化.化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功下调靶基因VEGF的表达,抑制MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法.     

应用siRNA技术探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF对树突状细胞的影响

为探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor, VEGF）对树突状细胞（dendritic cell, DC）功能及其分化的影响,针对VEGF基因设计siRNA（small interfering RNA, siRNA),采用脂质体转染法以100 nmol/L最佳转染浓度导入MCF-7乳腺癌细胞（siRNA组）,以脂质体Lipofectamine　2000TM转染MCF-7 乳腺癌细胞培养上清培养正常DC作为对照（对照组）,采用ELISA法检测经siRNA 干扰VEGF基因后的MCF-7 乳腺癌细胞分泌的VEGF因子含量, Western 印迹检测VEGF蛋白表达,以探讨siRNA的基因沉默效果;以siRNA组和对照组培养上清分别培养外周血单个核细胞,用流式细胞仪检测所诱导DC表型CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,用MTT法检测转染前后两组DC 诱导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）对MCF-7细胞的细胞毒作用.结果显示,MCF-7 乳腺癌细胞培养上清能明显抑制正常DC分化成熟及抗原递呈能力,干扰VEGF基因后MCF-7 乳腺癌细胞培养上清对DC的影响明显降低,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达较对照组显著升高,而CD1a表达下降（P＜0.01）.转染前后DC 诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤活性有明显差异（P＜0.01）.由此可见,siRNA可靶向抑制MCF-7乳腺癌细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7 细胞上清对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低,从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用.     

整合素αvβ3对MDA-MB-231BO乳腺癌细胞AKT信号通路的调控

旨在探究整合素αvβ3的单克隆抗体LM609在BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中对AKT(蛋白激酶B)信号通路的影响。利用免疫细胞化学法检测BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中整合素αvβ3的表达量。BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231BO细胞,Western blotting在蛋白水平检测磷酸化AKT的表达,MTT试验和细胞划痕试验分别检测细胞增殖、迁移能力的变化。结果显示,与231BO-Scrambled细胞相比,231BO-BSP27细胞中BSP蛋白水平明显降低,抑制率达到(59.43±1.71)%;LM609分别处理两株细胞后,与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组21BO-BSP27细胞中AKT磷酸化水平下调明显,为(33.78±1.51)%(P<0.01);231BO-BSP27细胞和对照组231BO-Scrambled中细胞的增殖和迁移能力均有不同程度的下降(P<0.05)。LM609能够抑制胞内整合素αvβ3功能的表达,进而对AKT信号通路进行调控,并影响细胞增殖和迁移的发生。     

抗TGFβ1核酶以及嵌合型核酶的细胞外和肝星状细胞内活性鉴定

大量研究表明转化生长因子β1参与细胞的多种生理和病理过程. 为了研究TGFβ1在这些过程中的详细发病机制, 设计了针对TGFβ1的非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶. 鉴定非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶的胞外以及活化型肝星状细胞内的活性. 核酶的胞外切割反应结果证实, 非嵌合型核酶的胞外活性优于U1小核RNA嵌合型核酶. 进一步研究发现, U1小核RNA嵌合型核酶在转染的肝星状细胞内可以高效下调TGFβ1的表达, 且其胞内活性明显强于非嵌合型核酶. 这些结果表明, 抗TGFβ1的U1小核RNA嵌合型核酶不仅为TGFβ1在细胞的生理和病理过程中具体作用机制的研究提供一种有效的工具, 而且有望为TGFβ1相关性疾病的治疗提供一个有效手段.     

siRNA干扰Mad2蛋白的表达对乳腺癌MCF-7细胞紫杉醇药物敏感性的影响

目的研究纺锤体检测点蛋白Mad2对乳腺癌细胞MCF-7紫杉醇敏感性的影响。方法运用小片段干扰RNA技术下调MCF-7细胞中Mad2蛋白的表达,经不同浓度的紫杉醇药物浓度处理,通过细胞术检测细胞周期分布,MTY法检测细胞存活率的变化,RT—PCR及Western印迹法检测相关蛋白的表达改变情况。结果siRNA可以特异性干扰MCF-7细胞中Mad2蛋白水平的表达,同时显著降低紫杉醇诱导细胞发生有丝分裂阻滞的比例,导致CyclinB1的表达下调,凋亡率降低;并且Mad2表达下调后,MCF-7细胞中黏附分子E-cadherin的表达量也降低。结论Mad2在紫杉醇诱导MCF-7细胞发生有丝分裂周期阻滞中发挥重要作用,进而影响细胞对紫杉醇的敏感性,同时细胞黏附分子E—cadherin可能参与这一过程的发生。