烟草中一条新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用差异显示技术从烟草中分离到一个受乙烯利诱导表达的cDNA片段,结合RACE扩增技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1350个碱基,编码区有1170 bp,通过GenBank同源性比较发现它与一条已知的烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS1,EC2．5．1．6)的基因编码区存在90％的同源性,编码的氨基酸顺序96％同源,而在cDNA的5’及3’非编码区同源性很低,且有一些短片段的缺失。设计合适的引物分别对这两个SAMS基因进行RT-PCR分析表明,SAMS1基因受高温诱导表达增强,但不受甲基紫晶诱导的氧化胁迫及盐胁迫影响,而新分离到的这个基因(SAMS2)的表达同时受高温、甲基紫晶及高盐3种胁迫的诱导。     

中国杯萼海桑遗传多样性的ISSR研究

杯萼海桑(Sonneratia alba J.Smith.)是海桑科红树植物,在我国分布于海南岛的东海岸.本文采用简单序列霞复区间扩增(ISSR)分子标记技术对分布于海南岛的杯萼海桑的4个天然居群和东寨港红树林自然保护区引种的一人工居群共100个个体进行了遗传变异分析.11个引物共扩增出133条带,其中103条具多态性,多态位点百分率为77.44%.在居群水平上相对较低,多态位点百分率为51.88%～65.41%,平均为57.74%.期望杂合度、香农信息指数在物种水平上分别为0.227 1和0.348 9;在居群水平上分别为0.1 83 7和0.227 5.依据Gst值,杯萼海桑绝大多数遗传变异发生在居群内的个体间(81.02%),18.98%的遗传变异发生在居群间.AMOVA分析也表明了类似的遗传结构.居群间平均遗传一致度为0.934 2.依据Nei(1972)的遗传距离对不同居群进行UPGMA聚类,将居群分为两组,来自三亚(SY)和陵水(LS)的居群聚为一类;东寨港引种栽培的人工居群(DZ)和琼海(QH)、文昌(WC)的居群聚为另一类.Mantel检验表明,遗传距离与地理距离呈极显著相关.     

中国杯萼海桑遗传多样性的ISSR研究

杯萼海桑(SonneratiaalbaJ.Smith.)是海桑科红树植物,在我国分布于海南岛的东海岸。本文采用简单序列重复区间扩增(ISSR)分子标记技术对分布于海南岛的杯萼海桑的4个天然居群和东寨港红树林自然保护区引种的一人工居群共100个个体进行了遗传变异分析。11个引物共扩增出133条带,其中103条具多态性,多态位点百分率为77.44%。在居群水平上相对较低,多态位点百分率为51.88%~65.41%,平均为57.74%。期望杂合度、香农信息指数在物种水平上分别为0.2271和0.3489;在居群水平上分别为0.1837和0.2275。依据Gst值,杯萼海桑绝大多数遗传变异发生在居群内的个体间(81.02%),18.98%的遗传变异发生在居群间。AMOVA分析也表明了类似的遗传结构。居群间平均遗传一致度为0.9342。依据Nei(1972)的遗传距离对不同居群进行UPGMA聚类,将居群分为两组,来自三亚(SY)和陵水(LS)的居群聚为一类;东寨港引种栽培的人工居群(DZ)和琼海(QH)、文昌(WC)的居群聚为另一类。Mantel检验表明,遗传距离与地理距离呈极显著相关。     

条斑紫菜SAMS基因克隆与生物信息学分析

干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的主要逆境因子。S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase,SAMS）与植物抗逆境密切相关,而且超表达SAMS的转基因植物具有更高的抗干旱、高盐和低温能力。进行条斑紫菜（Porphyra yezoensis）S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（PySAMS）cDNA的克隆及序列特征分析。首先利用电子克隆技术得到基因相关的contig,预测全长并设计引物,最后利用RT-PCR技术成功克隆了PySAMS的cDNA序列（GenBank accession：FJ404748）。该cDNA序列含有长1155nt的完整ORF,编码蛋白（PySAMS）分子量41.8kDa,长384AA。PySAMS与盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）等多种生物的SAMS具有较高的序列一致性,含有与SAMS酶活性密切相关的氨基酸残基和保守序列,与人（Homo sapiens）和大肠杆菌（Escherichia coli）的SAMS具有高度相似的三维结构。所以PySAMS与其它生物的SAMS一样,在条斑紫菜的抗逆过程中发挥重要作用。研究PySAMS有助于阐明条斑紫菜耐受非生物胁迫的作用机理,有助于获得高抗逆转基因植物。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:克隆与表达大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因。方法:应用PCR技术从E.coliBL21(DE3)的总DNA中扩增出1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,将其连接到PGEMT载体上,测序证明正确后再将目的基因插入大肠杆菌高表达载体PET28a中,含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达与分析。结果:SAM合成酶在E.coliBL21(DE3)中的表达量达到23.6%,酶活达到4.17μmol/h.ml。结论:大肠杆菌表达出了具有生物活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。     

啤酒酵母AS2.1416海藻糖合成酶基因tps1的cDNA克隆及序列分析

海藻糖 (Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ,α ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ α 1,1 Ｄ ｇｌｕｃｏｐｙｒａ ｎｏｓｅ)是一种非还原性二糖 ,广泛存在于藻类、细菌、昆虫、无脊椎动物及酵母等许多生物体内。海藻糖除了作为一种储存性碳源外 ,业已被证明在许多逆境 ,诸如高温、高盐、干旱、重金属离子污染、冷冻、辐射等情况下 ,可以有效地保护生物的细胞膜、蛋白质及核酸[1～ 6] 。海藻糖合成酶为一多酶体系。在酵母细胞中 ,其合成分为两步进行。第一步 ,在 6 磷酸海藻糖合成酶 (Ｔｐｓ1)的作用下 ,由ＵＤＰ 葡萄糖和葡萄糖 6 磷酸合成海藻糖 6 磷酸 …     

毛葡萄芪合成酶基因的克隆及序列分析

芪合成酶是白藜芦醇生物合成过程中起关键作用的酶.通过RT-PCR,从高抗葡萄黑痘病的中国野葡萄毛葡萄商-24克隆了芪合成酶基因家族的2个成员VqSTS1和VqSTS2,其cDNA全长均为1 179 bp,编码392个氨基酸.氨基酸序列分析表明,VqSTS1和VqSTS2编码氨基酸247-257位点的IPN（S/F）AGAIAGN ＂是芪合成酶家族固有的氨基酸保守结构域,368-378位点的GVLFGFGPGLT＂是芪合成酶与查尔酮合成酶家族固有的保守序列特征.在编码的392个氨基酸中,VqSTS1和VqSTS2仅有12个氨基酸不同,氨基酸一致性达97%.多重比较分析显示,VqSTS1与VqSTS2与五针松、河岸葡萄、白粉藤、华东葡萄及欧洲葡萄等STS在氨基酸水平的一致性分别为65%、96%、97%和98%.将VqSTS1和VqSTS2登录GenBank,登录号分别为EF158856和EF158857.     

植物中SAM Mtases基因研究进展

SAM Mtases是从多种植物中分离到的一类S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性氧位甲基转移酶基因,该基因对植物体内木质素、类苯基丙烷、类黄酮类、生物碱和脂肪族化合物等许多次生代谢产物合成有直接的影响,并且在植物抗病、抗紫外线、杀虫、抗菌、植物激素生长和信号调节、植物共生、花粉管伸长和花粉生长等生理过程中起重要作用.该文总结了国内外已经克隆到的SAM Mtases同源基因的分离、分类及其功能,为进一步研究SAM Mtases基因在植物生理代谢调控中的地位及在植物抗性及药用成分育种上的应用提供参考.     

嗜热古菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的序列分析、基因克隆与异源表达

将Methanopyrus sp.SNP6进行功能基因组测序,获得S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam)序列,并进行序列分析。将sam基因扩增后连接至表达质粒p ET-28b(+),转化E.coli BL21(DE3),获得重组菌后进行诱导表达。生物信息学分析表明,sam基因编码蛋白的理论分子量为44 086.4Da,三级结构为同源四聚体,与其他相关古菌来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的蛋白序列较保守。实验结果显示,构建的重组表达质粒p ET28b(+)-sam可在E.coli BL21(DE3)宿主菌中高水平表达。重组蛋白的分子量与预期值基本一致,部分为胞内可溶性表达,另一部分以包涵体形式存在。本研究首次实现了Methanopyrus sp.SNP6菌株S-腺苷甲硫氨酸合成酶的异源表达,为后期的蛋白纯化、酶学性质研究和酶促转化法生产S-腺苷甲硫氨酸奠定了理论基础。     

毕氏酵母胱硫醚合成酶基因的克隆和序列分析

胱硫醚合酶（cystathione beta-synthase,CBS）是半胱氨酸代谢中一个重要的酶。以PCR技术为主,克隆了毕氏酵母来源的CBS基因。首先基于不同来源的CBS基因的序列比对,设计了一对CBS的性简并引物,用它扩增出毕氏酵母CBS基因的一个保守片段。根据这段DNA的序列,设计了5′RACE和3′RACE的引物,分别克隆了该基因的3′区和5′区。由此装配出完整的毕氏酵母的CBS基因序列。该基因编码了一种501个氨基酸残基的蛋白质。核苷酸序列和氨基酸序列的排比显示该基因与酿酒酵母来源的CBS基因有较高的相似性。破坏该基因,造成毕氏酵母的半胱氨酸生长依赖性。该序列已存入GenBank／EBM／DDBJ数据库,其登录号为No.AF367364。     

独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

AP2/ERF是广泛存在于植物中一类重要的转录因子,调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能,该研究基于前期对独行菜(Lepidium apetalum)转录组数据库分析,克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp,编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域,属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD,等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性,系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明,LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段,无跨膜区,不属于分泌蛋白,可能为亲水性蛋白;定位于细胞质的可能性为56.5%,定位于细胞核的可能性为21.7%;其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α-螺旋。Real-time PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4℃处理下的表达,显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。     

无瓣海桑与乡土红树植物混交对林地大型底栖动物的影响

选择广东省雷州市附城镇和珠海市淇澳岛沿海1年生无瓣海桑人工林,分别在林下混种乡土红树植物红海榄或木榄幼苗,对混交林和无瓣海桑纯林林地大型底栖动物群落进行比较,探讨无瓣海桑与乡土红树植物混交对林地大型底栖动物的影响。结果显示,混交林和无瓣海桑纯林之间大型底栖动物群落的优势种存在差异;相似性分析检验(One-Way ANOSIM)、等级聚类和非参数多变量标序结果均表明1年无瓣海桑+红海榄混交林、1年无瓣海桑+木榄混交林和1年无瓣海桑纯林之间大型底栖动物群落结构差异显著。研究还发现在无瓣海桑人工林林下混交红海榄或木榄这两种乡土红树植物,可提高林地底栖动物的生物量和物种多样性。BIOENV分析说明大型底栖动物分布与红海榄或木榄这两种混交的乡土树种的凋落物量密切相关,这进一步证实了混交乡土红树植物对林地底栖动物多样性和分布的影响。两个研究地实验结果均显示,在无瓣海桑林下种植木榄的效果要优于红海榄,表现在木榄的平均苗高、凋落物量、凋落物量占群落凋落物总量百分比和幼苗成活率均高于红海榄,其对提高林地大型底栖动物生物量和物种多样性的效果也明显优于红海榄。     

沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

植物自交不亲和性是植物生殖过程中普遍存在的一种现象,是植物特异性识别并拒绝自身花粉或亲缘关系很相近的花粉的一种遗传机制。无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,IPPase)在植物生长发育方面起重要作用。该研究根据沙田柚花柱消减文库中EST序列(无机焦磷酸酶基因内部片段),设计了2对特异引物5'-GSP1,5'-n GSP1,3'-GSP2 and 3'-n GSP2,通过SMART-RACE PCR技术从所构建的沙田柚花柱抑制性消减文库中克隆了沙田柚无机焦磷酸酶基因的c DNA全长序列,利用Blastn、DNAman和Expasy软件对所克隆的基因进行同源性分析,以及基因编码的氨基酸的分子量、等电点、疏水性等理化性质分析。结果表明:IPPase基因c DNA全长为1 136 bp(Gen Bank登录号为KF990474),开放阅读框(ORF)全长为654 bp,共编码217个氨基酸,包括170 bp 5'UTR和312 bp的3'UTR;编码的蛋白质的分子量为24.4 k Da,等电点为5.96;蛋白结构域分析显示沙田柚IPPase与焦磷酸酶具有相同的保守结构域;对沙田柚IPPase蛋白质序列进行疏水性分析,结果表明沙田柚IPPase基因编码的肽链中疏水性最大值约为3.21,最小值约为-2.98,属于亲水性蛋白,无跨膜区域;Blastn搜索的结果显示,沙田柚IPPase基因序列与多种植物的IPP基因高度同源;序列分析表明,沙田柚IPPase基因核苷酸的同源性与毛果杨(Populus trichocarpa)和橡胶树(Hevea brasiliensis)IPPase基因均为87%;氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)无机焦磷酸酶完全一致。该研究结果可为深入研究无机焦磷酸酶在沙田柚自交不亲和中的作用机理提供基础。     

苦荞4-香豆酸辅酶A连接酶基因(Ft4CL)的克隆及序列分析

以苦荞栽培种‘西荞2号’为材料,利用同源克隆和RT-PCR技术获得Ft4CL保守片段,采用RACE技术获得Ft4CL基因的3'末端及5'末端序列,并进一步采用生物信息学方法进行序列分析。结果表明:从苦荞花蕾总RNA中获得一条苦荞麦(Fagopyrum tatarium)4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4-coumarate:Coa ligase,Ft4CL)的cDNA全长序列。生物息学分析结果显示,Ft4CL基因ORF全长1 602 bp,可编码553个氨基酸,理论标准分子质量为58.02kDa,等电点(pI)为5.23。该研究首次从苦荞中获得Ft4CL基因的cDNA全长序列,该基因具有植物4CL同源基因的典型特征,推导的氨基酸序列具有4CL的所有活性位点并归属于黄酮代谢支路。该研究结果可为深入研究苦荞黄酮代谢途径奠定基础,为采用代谢工程技术提高苦荞黄酮含量提供候选靶基因。     

割手密醛脱氢酶ScALDH基因的克隆与表达分析

该研究从甘蔗细茎野生种(割手密Saccharum spontaneum)中克隆抗旱相关的基因Sc ALDH,并分析其在干旱处理条件下的表达情况和序列特征。利用RT-PCR技术克隆甘蔗的ALDH基因片段,并对其核苷酸和氨基酸序列进行分析。使用NCBI Blastx、ORF finder、Mega、NCBI Conserved Domain Search等程序对其分别进行不同物种氨基酸比较、开放阅读框(ORF)寻找、进化树及保守序列分析,并用Real Time-PCR分析所克隆基因在干旱胁迫前后的表达差异。结果表明:克隆出甘蔗的ALDH基因片段,总长度为1996bp,其中蛋白质编码区(CDS)全长1524bp,编码508个氨基酸;与其它物种ALDH类蛋白氨基酸序列有很高的同源性,有ALDH家族的保守序列,并含有完整的开放阅读框,系统进化树分析显示与玉米的蛋白质亲缘关系最近;Real timePCR数据表明,在干旱胁迫下,随着干旱时间的延长,该基因的表达量呈持续积累的表达模式。总体上来说,该基因对干旱胁迫显著表达。利用RT-PCR技术克隆的甘蔗ALDH基因,属于ALDH蛋白家族的一员,具有其典型的功能域,该基因在干旱胁迫过程中参与抗旱作用。该研究结果为野生种资源开发、优良抗旱亲本选择和培育抗旱性强甘蔗品种提供了参考依据。     

苹果乙烯不敏感基因EIN2片段的克隆及序列分析

分别以苹果果实总DNA和cDNA为模板,采用PCR、RT-PCR方法扩增、克隆乙烯不敏感基因(ethyleneinsensitive 2,EIN2),并利用生物信息学方法分析其核苷酸序列和蛋白质结构。结果表明:(1)以DNA和cDNA为模板的扩增结果完全相同,扩增的EIN2基因片段为4 378bp,尚未发现有内含子,开放阅读框全长3 282bp,编码1 093个氨基酸;苹果EIN2相对分子质量为118.9kD,等电点为5.52,其蛋白可能为脂溶性疏水蛋白。(2)所克隆苹果EIN2基因编码的氨基酸序列与拟南芥(AAD41077.1)、碧桃(ACY78397.1)和葡萄(CAN66374.1)EIN2基因编码的氨基酸序列一致性分别为52%、79%、62%。(3)构建的EIN2基因进化树显示,拟南芥、小盐芥、甜瓜、杨毛果EIN2基因亲缘关系较近,聚为一类;葡萄为一类;蒺藜苜蓿为一类;碧桃、矮牵牛、西红柿聚为一类;苹果单独为一类。而且苹果EIN2基因与碧桃等同源基因的亲缘关系相对较近,与拟南芥、小盐芥同源基因的亲缘关系相对较远。     

大花杓兰亲环素基因的克隆及生物信息学分析

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析。结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸。预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质。磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点。蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素。对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现。系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近。该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础。     

Genetic variation within the endangered mangrove species Sonneratia paracaseolaris (Sonneratiaceae) in China detected by inter-simple sequence repeats analysis

Sonneratia paracaseolaris, is a critically endangered mangrove species in China. Using inter-simple sequence repeats (ISSR) markers, we compared the genetic variation of introduced populations with that of natural populations to check whether the genetic diversity has been conserved. At the species level, genetic diversity was relatively high (P = 81.37%, He = 0.2241, and SI = 0.3501). Genetic variation in introduced populations (P = 75.78%, He = 0.2291, and SI = 0.3500) was more than that in natural populations (P = 70.81%, He = 0.1903, and SI = 0.2980). Based on Nei's G_ST value, more genetic differentiation among natural populations was detected (G_ST = 0.3591). Our data show that the genetic diversity of S. paracaseolaris was conserved in introduced populations to some extent, however, owing to the small natural populations and the threats they encountered, more plants should be planted to enlarge and restore the populations.     

广藿香八氢番茄红素合成酶PcPSY1基因克隆和序列分析

根据已获得的广藿香转录组数据中的PSY转录本序列,利用Primer 3在线设计基因全长扩增引物,采用RT-PCR方法获得广藿香的八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)基因。并利用在线分析平台和生物软件对该其因进行生物信息学分析。获得的广藿香PSY1基因长1 550 bp,编码439个氨基酸,命名为PcPSY1,GenBank登录号为KC862310; 预测了PcPSY1 编码蛋白的结构与功能,且基于PSY基因利用NJ法构建了与21个不同物种间的进化树,进化树表明广藿香PcPSY1基因与桂花的PSY序列亲缘关系最近。成功克隆并分析广藿香PcPSY1基因的全长序列,为进一步阐明广藿香萜类代谢途径奠定基础。     

柠条锦鸡儿F3H基因克隆及功能分析

柠条锦鸡儿为豆科灌木,对各种环境胁迫具有较强的适应能力,类黄酮是天然的抗氧化剂,花青素属类黄酮化合物,逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成,而黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因,命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框(ORF)为1095 bp,编码364个氨基酸,推测的蛋白质分子量为41.3 kDa,理论等电点为5.9。生物信息学分析发现,CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性,推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列,PlantCARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导,并且在低温胁迫下,CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述,研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。