HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

基于逆转录病毒载体的外源基因表达系统的评价和应用

逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的表达水平和稳定性为指标,比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1(+) 表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度 (Relative fluorescence intensity,RFI) 均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染HEK293细胞的RFI值约提高2倍。此外,逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C (Recombinant human activated protein C,rhAPC) 基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率,构建了rhAPC表达水平为10~15 mg/(106 cells·d) 的HEK293细胞系。研究结果表明,逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。     

NIPSNAP3A短发夹RNA腺病毒载体的构建及病毒包装

目的:构建靶向NIPSNAP3A的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,干扰HEK293A细胞中NIPSNAP3A的表达。方法:设计靶向NIPSNAP3A的shRNA,插入穿梭质粒pENTRY,通过Gateway法获得腺病毒颗粒pAd-NIPSNAP3A-shRNA,转染HEK293A细胞,在细胞内包装获得腺病毒。结果:重组腺病毒载体经酶切鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能显著抑制NIPSNP3A蛋白的表达。结论:干扰HEK293A细胞NIPSNAP3A表达的shRNA重组腺病毒载体构建成功。     

pAd—SIG腺病毒质粒构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的含人生长抑素受体2亚型（ human somatostatin receptor subtype 2, hSSTr2 ）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）的腺病毒重组质粒的构建及表达。方法采用PCR方法将hSSTr2以及IRES-EGFP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle—CMV中,获得pShuttle-CMV／hSSTr2-EGFP,经PmeI酶切,去磷酸化后转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183菌,细菌内同源重组构建腺病毒质粒pAdeasy-1／hSSTr2．EGFP（pAd．SIG）,将其转染HEK293细胞进行病毒包装与滴度测定。重组腺病毒感染MCF-7细胞,流式细胞术检测其表达。结果酶切、PCR及基因测序证实重组腺病毒质粒pAd-SIG构建成功,病毒滴度为8．2×10^9 IU／ml,流式细胞术结果显示hSSTr2在MCF-7细胞中表达阳性率为86．59％。结论成功构建了区组腺病毒质粒pAd-SIG,并能在真核细胞表达,为体内外研究hSSTr2效应提供了基础。     

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。     

应用Ad Easy载体系统构建人β2-AR基因重组腺病毒

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将β2-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建pAdTrackCMV-β2AR重组质粒,经PmeI酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测β2-AR的表达.结果:琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒.重组穿梭载体经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实.电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacⅠ酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段,证实获得同源重组质粒.转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白,以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带β2-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人β2-AR基因的腺病毒,为进一步研究人β2-AR基因治疗奠定了基础.     

应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将人SERCA2a基因全长c DNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMV SERCA2a重组质粒,经Pme I酶切线性化,采用电击法转入到已含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性.结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径.     

Varp过表达降低腺病毒感染细胞效率的研究

目的：探讨Varp蛋白对腺病毒感染细胞效率的影响.方法：构建稳定表达Varp蛋白的HEK293细胞株,用携带EGFP基因的腺病毒载体感染细胞,通过荧光显微镜观察及Western Blotting等方法检测腺病毒对不同细胞感染效率的差别.结果：腺病毒对稳定过表达Varp蛋白的细胞的感染效率较对照细胞明显下降.结论：Varp蛋白在细胞中稳定过表达能够降低腺病毒感染细胞的效率.     

人H-ras基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的促进作用

目的:构建癌基因H-ras真核表达载体,并检测其对肿瘤细胞生长的作用。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增H-ras基因片段,将其插入p XJ-40-myc载体后转染人胚肾HEK293T细胞,用Western印迹检测该融合蛋白的表达;将重组质粒转染人肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞,通过细胞生长曲线(CCK8法)对myc-H-ras影响肿瘤细胞生长的情况进行分析。结果:利用PCR技术,从乳腺文库中扩增出H-ras基因片段,并成功插入p XJ-40-myc载体;重组质粒转染HEK293T细胞,经Western印迹检测融合蛋白正确表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-H-ras的结肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞比转染空载体的细胞生长快。结论:构建了人H-ras基因真核表达载体,为进一步研究ras基因在肿瘤细胞中的作用奠定了一定基础。     

人尿激酶型纤溶酶原激活因子截短型突变体与绿色荧光蛋白在真核细胞HEK293F中的融合表达

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)截短型突变体与绿色荧光蛋白(EGFP)分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达。方法:采用PCR法,分别以质粒pIRES2-EGFP和重组质粒pcDNA3.1(+)/uPA为模板,扩增出带BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的EGFP及带NheⅠ和HindⅢ酶切位点的uPA截短体基因片段,先后将EGFP和截短型uPA基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,转入HEK293F细胞,用G418对转染细胞进行加压筛选,通过共聚焦显微镜观察和ELISA方法鉴定表达产物。结果:DNA测序结果显示,uPA不同截短型突变体基因片段与EGFP基因融合的真核表达载体构建成功,共聚焦显微镜观察发现HEK293F细胞中有绿色荧光且定位于细胞质中,ELISA检测到HEK293F细胞培养上清中分泌型融合蛋白的表达。结论:构建了uPA截短型突变体与EGFP分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达,为后期研究uPA的相互作用蛋白及其生理功能奠定了基础。