昆虫病毒多角体蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

将含有大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)多角体蛋白基因(ocu)的BamHl一H片段克隆到表达载体pDR 540的BamiHl位点,得到能抗高浓度氨苄青霉素(200μg／ml)的两个阳性重组体,其胞外总蛋白比亲本质粒高1．1-1．4倍。在大肠杆菌细胞中,BsNPV ocu基因在原核杂合启动子tac驱动下能高水平的表达,表达量达到0．8和4．7mg／ml。免疫沉淀反应证明,表达蛋白为BsNPV的包涵体蛋白,凝胶过摅法测定的平均分子量为32.1×103道尔顿。     

大尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白基因的结构分析

大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)的多角体蛋白基因(ocu)定位在2．3kb的BamHl—H片段上,用xho1、sma1、HindIII和PstI构建了H片段的物理图谱,并测定了两端636bp序列。在5’端发现了杆状病毒ocu基因共有的典型特征,即：ATG起始区;启动子区(14bp保守序列);TATA box和CATA box区等。单一xhoI位点在ATG上游-15bp处,适于作为构建ocu基因转移载体的插入位点。在这一基因5’端序列中发现了五个反转重复单元CGAGC GCTCG,讨论了这一单元在杆状病毒ocu基因高效表达中的调控功能。     

双基因双重组AcNPV的构建及其杀虫活性

质粒pAcIEneo携带杆状病毒极早期基因IE1启动子驱动的新霉素抗性基因(neo),经酶切回收后插入到质粒pAc34DZ1的SacI位点上,构建成多角体外膜蛋白基因(pe)失活的转移载体pAc34DZ2。我们曾构建了一个多角体完整(ocu+)的表达苏云金杆菌(Bt)截短cryIab基因的重组病毒(1)vAcPhBtT。为了改进这一重组病毒的杀虫效率,将转移载体pAc34DZ2与重组病毒(1)vAcPhBtT DNA共转染Sf9细胞,进行第二次同源重组。由于neo基因的表达,用G418筛选得到重组病毒(2)vAcPhBtTPE^-;Southern blot证明vAcPhBtTPE-的构建是正确的,经SDS-PAGE分析,重组病毒(2)仍然能在昆虫细胞中表达80kD的Bt截短毒蛋白,但不表达34kD的多角体外膜蛋白。电镜观察重组病毒(2)无多角体外膜,碱解时病毒粒子释放的速度快于重组病毒(1)。以重组病毒(2)感染甜菜夜蛾三龄幼虫,LC₅₀比野生型病毒小了接近1倍,LT₅₀提前近2d。     

绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞中的克隆与表达

将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到转移载体pVLneo的多角体蛋白基因(ocu)启动子下游,与杆状病素AcNPV DNA共转染昆虫细胞,通过同源重组和G418筛选,构建了整合有GFP基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的GFP,MW为30kDa,在荧光显微镜下呈现美丽的绿色,荧光光谱表明其激发波长395nm,发射波长509nm。Southern blot杂交证明,重组病毒的1kb EcoRI片段与GFP cDNA探针有很强的杂交信号,这是GFP基因在杆状病毒基因组中整合的直接证据。     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBACHTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBACS10,重组穿梭质粒BacmidS10,重组杆状病毒AcS10。多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测。结果表明:S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核。     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBAC HTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBAC S10,重组穿梭质粒Bacmid S10,重组杆状病毒Ac S10.多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测.结果表明S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核.     

表达乙型肝炎病毒表面抗原基因又形成多角体的杆状病毒

用形成包含体(OCC~+)并能利用人工合成启动序列和多角体XIV启动子表达外源基因的转移载体质粒pSXIVVI~+X3,将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因和多角体基因同时插入无包含体的粉纹夜蛾核型多角体病毒TnNPV-SVI-G基因组中,得到表达HBsAg基因又形成包含体(多角体)的重组毒侏TnNPV-HBs85-OCC~+。与利用野生型多角体启动子表达HBsAg基因的无包含体毒株TnNPV-HBsD4不同,TnNPV-HBs85-OCC~+由于具包含体,能以口服方式大规模感染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫,且HBsAg基因在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞中的表达量要比前者高约37％,在虫体中的表达则更高。     

以家蚕核型多角体病毒为载体高效表达天花粉蛋白基因

本文报道以家蚕核型多角体病毒为载体,在家蚕体内高效表达天花粉蛋白基因的结果。天花粉蛋白基因是用ＰＣＲ技术从栝楼基因组中分离的,该基因被插入到家蚕核型多角体病毒转移载体质粒ｐＢｍ-１的多角体蛋白基因启动子下游,构建成重组质粒ｐＢｍＴＣＳ。将重组质粒ＤＮＡ和野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕培养细胞,通过在家蚕培养细胞中进行同源重组和筛选,获得了无多角体的重组病毒ＢｍＴＣＳ。采用ＰＣＲ技术对重组病毒进行了鉴定,证实重组病毒合天花粉蛋白基因。重组病毒对家蚕的感染性不及野生病毒,提示表达产物对病毒的增殖有抑制作用。对重组病毒感染的家蚕血淋巴进行了ＳＤＳ-ＰＡＧＥ和免疫印迹分析,结果显示在蚕体血淋巴中的表达产物天花粉蛋白占总蛋白的５％。本实验为利用基因工程方法大量生产天花粉蛋白提供了又一条新的途径。     

杆状病毒表达载体系统

杆状病毒表达载体系统是近年来发展起来的较高效的表达外源基因系统。由于多角体病毒中多角体蛋白基因的非必需性、高表达性、重组病毒的易鉴定等特性,以及多角体蛋白基因的强启动子使其特别适于基因工程中作为表达载体,借助于转移载体可将外源目的基因转移到野生型AcMNPV中,在一个被转移载体和野生型AcMNPV共转染的细胞内,可以通过同源重组完成目的基因的转移。应用不同的转移载体可表达出融合及非融合蛋白质。经该系统表达的重组蛋白质具有生物学活性,其中大部分进行翻译后剪接产生与天然蛋白质相似的重组蛋白质。这些产物的抗原性,免疫原性和功能都与天然蛋白质非常相似。目前,应用该系统已成功地表达了许多酶、生长因子、病毒抗原包括病毒的外壳蛋白等有生物活性的蛋白质。本文对如何最大限度表达外源基因及该表达系统的发展前景作了讨论。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

家蚕核多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus.BmNPV)和家蚕细胞已成功地用来大量生产具有生物活性的重组蛋白。但是BmNPV的通用载体的类型较少。因此,本实验构建了BmNPV新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的 12位外连接有5个外源基因的克隆位点。将HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的 12位后,构建了pBmIFN 12;同时构建HuIFN-β克隆在-3位后的转移栽体pBmIFN-3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm-N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN-β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN 12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性最高时可达2.0×10~6IU/ml,将BmIFN 12注射5龄家蚕虫体,表达水平为50×10~7IU/ml,是HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒的表达量的2～4倍。家蚕体生产的rHulFN-β为糖基化蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因5'端截短片段的表达及增效活性测定

将带有棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白(HaGV enhancin)基因的重组表达载体pET-30a-En分别用Bal Ⅰ和Dra Ⅰ酶切后连接,构建重组表达载体pET-30a-Ben和pET-30a-Den,其外源基因的开放阅读框分别为HaGV增效蛋白基因5'端的1.7kb和2.2kb.IPTG诱导表达产生66.7kD和85.1kD的多肽并命名为Ben和Den.初步纯化的Ben和Den显示了对棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)及Bt的增效活性.Ben可对棉铃虫核多角体病毒增效10.5%～26.5%,LT50缩短0.9d,Den增效10.2%～33.0%,LT50缩短1.2d～1.9d.重组增效蛋白可对Bt(12500稀释)增效20.7%～35.4%,Den增效16.7%～31.5%,Ben增效¨.7%～27.4%.这为进一步研制抗虫工程菌打下了良好的基础.     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)DNA的提纯及多角体蛋白基因片段的克隆

本文报道了从被AcNPV感染的大蜡螟中提纯到AcNPV DNA,以质粒pBR325作为载体,从AcNPV基因组DNA EeoRI片段克隆中得到含AcNPV多角体蛋白基因片段的重组质粒。经原位杂交,酶切鉴定,DNA顺序分析,并与Hooft Van Iddekinge等人测定的结果比较,证明筛选到的7.3kb EcoRI片段包含了AcNPV多角体蛋白结构基因及其启动基因。核多角体病毒多角体蛋白启动基因是迄今为止在真核细胞中所发现的最强启动基因之一,是理想的表达外源基因的启动子。     

表达barnase基因的重组棉铃虫核型多角体病毒的构建及其杀虫活性研究

将含有 barnase基因与杆状病毒多角体基因 ( ph)的重组转座载体 p Fb- Bar在大肠杆菌中与含有棉铃虫核型多角体病毒 ( Ha NPV)的穿梭载体 Hanpvid转座并提取重组穿梭载体 DNA转染棉铃虫细胞 ,得到重组棉铃虫病毒 r Ha- Bar.其分子杂交证明 ,昆虫细胞中有 r Ha- Bar的 bar基因转录本存在 ,并能表达产生 33k D的多角体蛋白和 1 2 k D的 barnase.在平板上 ,barnase能降解RNA,出现清晰的降解圈 .r Ha- Bar对三龄棉铃虫幼虫的毒力比野生型 Ha NPV的 LD50 减少 2 0 % ,LT50 减少 30 % .用 barnase的拮抗基因 barstar构建了具有 Neo抗性、并能稳定表达 barstar的棉铃虫转化细胞 AM1 - NB.以携带 barnase基因的重组病毒 r Ha- Bar分别感染转化细胞和正常细胞 ,48h子代病毒在转化细胞中的产量比在正常细胞中高 2 3倍 ,72 h高 1 60倍 .     

转座子介导的多角体基因表达及提高病毒粒子的感染效率

现行的杆状病毒表达外源基因的方法是将外源基因取代病毒中的多角体基因,因而得到的重组杆状病毒感染活体时不能经口感染,只能进行针刺注射,效率低且易引起活体感染其他疾病。将家蚕核型多角体病毒(Bombyx mor inucleopolyhedrovirus,BmNPV)中的多角体基因(polyhedrin,poly)及其启动子片段克隆到转座子载体pigA3GFP中,将其与辅助质粒pHA3PIG利用脂质体介导法导入家蚕细胞中,经过多次筛选获得稳定的转基因家蚕细胞。之后先将BmPAK6(含LacZ)及BmGFP(含GFP)重组病毒分别感染转基因细胞,再将得到的重组病毒经口感染5龄家蚕幼虫。结果显示,重组杆状病毒可以经口感染家蚕幼虫。这些研究表明来自于转基因家蚕细胞的poly基因表达产物可以提高重组杆状病毒经口感染家蚕率,为解决杆状病毒表达系统中重组病毒不能经口感染家蚕幼虫的问题提供新思路。     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β—半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动了控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的,有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

一种新颖的棉铃虫单闰包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini-F replicon,一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内,构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid-HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒。利用HapFast BacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上。随后将含有eGFP基因的重组HZAml细胞内。转染5d后,细胞核内能形成典型的多角体,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。结果证明我们构建的HaBac to Bcac表达系统能有效的表达外源基因。