烟草环斑病毒IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

本研究首次应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-RealtimePCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了抗原抗体特异性结合、核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有显著提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题。     

烟草环斑病毒IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

本研究首次应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-Realtime PCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了抗原抗体特异性结合、核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有显著提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题.     

基于靶向结合的食源性诺如病毒富集与检测研究进展

诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是全球急性胃肠炎的重要食源性病原。复杂基质的前处理技术一直是食品安全领域中病毒检测研究的重点和难点。除了絮凝沉淀、超速离心、超滤浓缩、电荷膜过滤等常用的非特异性富集技术外,基于分子互作的靶向病毒富集技术已成为了近年来的研究热点。常用的靶向结合种类包括抗原-抗体结合、病毒-受体结合、筛选特异性的核酸适配体、基于噬菌体表面展示技术筛选特异性的多肽、分子印迹等。因此,本文对近年来诺如病毒靶向富集技术的研究进展进行了综述,以期为完善食源性病毒快速检测技术提供参考。     

猪肠病毒G (EV-G)荧光定量PCR检测方法的建立与四川地区分子流行病学调查

【背景】猪肠病毒G (Enterovirus G,EV-G)在猪群中普遍存在,可引起猪的皮肤损伤、肌肉麻痹、肺炎、发热、腹泻等,也存在无症状感染。【目的】建立检测EV-G的荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)方法并开展四川地区分子流行病学调查。【方法】根据EV-G的5ʹUTR基因保守序列设计特异性引物,建立可检测EV-G各基因型的RT-qPCR,并评估其灵敏性、特异性和重复性,开展四川地区EV-G的流行调查。【结果】标准品在1.89×10²-1.89×10⁸ copies/μL浓度范围内线性关系良好;在特异性试验中,其他9种猪病毒(猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、日本乙型脑炎病毒、猪萨佩罗病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒)检测均为阴性;最低检测浓度为1.89×10¹ copies/μL;组内和组间变异系数分别小于1%和2%。检测2013-2021年四川省431份猪腹泻样品,EV-G总体阳性率为31.1%,表明该病毒在四川地区的感染较普遍。随机选取9份四川的EV-G阳性样品扩增VP1基因并测序分析,发现四川EV-G流行的基因型包括G1、G3、G4和G9,但以EV-G1为优势基因型。【结论】本研究建立了一种检测EV-G各基因型的RT-qPCR方法,并初步掌握了四川EV-G的流行现状,为后续深入开展该病毒的研究奠定了基础。     

TaqMan探针双重荧光定量PCR同时检测解脲支原体和巨细胞病毒

目的探讨双重荧光定量PCR技术的优化条件,建立基于TaqMan探针技术荧光定量法检测同时检测解脲支原体和巨细胞病毒的新方法。方法分别采用普通定性PCR扩增母婴垂直传播常见的病原体（解脲支原体和巨细胞病毒）测序鉴定,然后分别采用TaqMan探针的单重和双重定量PCR技术对解脲支原体和巨细胞病毒同时定性定量检测。结果解脲支原体和巨细胞病毒单种定性PCR检测均为阳性,TaqMan探针单重和双重定量PCR检测解脲支原体和巨细胞病毒阳性率和特异性均为100％,相同样品TaqMan探针单重、双重定量PCR分别检测的结果符合率100％。结论TaqMan探针双重荧光定量PCR技术可同时检测两种靶分子,结果可靠,应用前景广阔。     

木毒蛾核型多角体病毒的PCR快速检测技术

【目的】木毒蛾是福建沿海地区防护林树种木麻黄的主要害虫之一,具有成为国际危险性有害生物的潜在可能性。木毒蛾核型多角体病毒(Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus,LyxyMNPV)是高效控制木毒蛾的优良天敌资源,具有高度安全性。建立LyxyMNPV的PCR快速检测技术,有利于该虫防治技术及木毒蛾核型多角体病毒的进一步研究。【方法】根据LyxyMNPV基因组中的特有基因gp131设计特异性引物,利用PCR法扩增该目的基因片段并测序检验,建立LyxyMNPV的分子快速检测技术体系。【结果】以GAL为引物的PCR检测技术对LyxyMNPV基因组的灵敏度可达1 fg·mL^-1,对多角体悬液浓度检测最低量可达5.0 PIB·mL^-1,可明确区分LyxyMNPV和其他7种昆虫核型多角体病毒。该体系同时适用于感病木毒蛾的不同虫态(卵、幼虫、蛹和成虫)的检测,以及环境样本(包括土壤、树枝和寄生蜂)的检测。【结论】成功建立了具有高度特异性、灵敏性的LyxyMNPV分子快速检测技术,为LyxyMNPV的快速检...     

H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

H13亚型禽流感病毒以往只在海鸥、鸭等水禽中被发现,2018年,我们实验室报道了蛋鸡感染H13亚型禽流感病毒的证据,表明H13亚型禽流感病毒存在从水禽中溢出感染陆禽的风险,因而有必要加强对H13亚型禽流感病毒的监测。实时荧光定量PCR由于具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点,在病原监测工作中得到了广泛应用。本研究以H13亚型禽流感病毒的HA基因作为靶基因,设计了一对特异性荧光定量PCR检测引物,通过特异性试验、敏感性试验等,建立了H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法,并应用建立的检测方法对海鸥粪便样品进行核酸检测。实验结果发现,该检测方法的灵敏度为1.60×10⁰拷贝/μL;该检测方法对H1、H3、H5、H6、H7和H9等6个亚型的禽流感病毒无交叉反应;该检测方法的敏感性是常规PCR的10倍;海鸥粪便样品中H13亚型禽流感病毒的核酸检测阳性率为18.8%。我们建立的H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点,该检测方法可用于大量临床样品的快速检测,为H13亚型禽流感病毒监测工作的顺利开展提供了技术支撑。     

分子信标探针用于PCR检测对虾白斑杆状病毒

将对虾白斑杆状病毒的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该病毒的PCR检测.温度与荧光强度之间的关系表明,所设计探针的发夹既可以形成也可以打开,符合PCR对分子信标探针的要求.结果表明,在PCR同时加入分子信标探针不影响PCR扩增,分子信标探针只能与目的DNA杂交,具有较高的特异性.随着PCR循环数的增加以及含目的DNA的质粒拷贝数的增加,荧光强度都随之增强.     

一步多重PCR同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒研究

建立的一步ＰＣＲ方法即反转录和ＰＣＲ在同一管中进行,同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒病毒ＲＮＡ。实验中对不同的反转录温度以及一步多重ＰＣＲ的特异性和灵敏度进行了探讨。结果表明：４２℃、５０℃反转录时ｐｏｌｉｏ有非特异性条带出现,６０℃反转录特异性较好,而ＨＡＶ在三种不同的反转录温度下均得到牧场划性较好的条带;应用一步ＰＣＲ同时检测两种病毒与检测单一病毒的灵敏度基本一致,但在同等反应条件下后者的反应效率高于前者,特别是在检测ＨＡＶ时。     

免疫捕获PCR法快速检测金黄色葡萄球菌

旨在建立一种快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)免疫捕获PCR技术,并探讨其灵敏度和特异性。SA特异性抗体包被PCR管以富集待测样品中目标菌,之后在同一PCR管里直接进行免疫捕获PCR,并和直接PCR比较。免疫捕获PCR法可特异性检测2株SA菌株,而无法检测到其它8种常见食源性致病菌,说明该方法对SA具有良好的特异性;该方法对纯菌液而言,检测灵敏度可达到2.35×102CFU/mL,是直接PCR的100倍;对5种食品模拟带菌检测发现,无需增菌培养,其灵敏度可达到2.35×103-2.35×104CFU/mL,是直接PCR的10-100倍。免疫捕获PCR法集免疫学与分子生物学检测技术于一体,具有高特异性、高灵敏度、检测快速、易于操作、成本低廉等诸多优点,是一种适合基层实验室使用的检测技术。     

新型冠状病毒纳米PCR快速检测方法的建立

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致致命性肺炎,且极具传染性。自2019年年末在我国出现以来,已在全球蔓延。为了建立一种灵敏、快速检测SARS-CoV-2的分子检测方法,本研究使用金纳米颗粒配合普通PCR检测方法,针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白建立了SARS-CoV-2 NanoPCR新型分子检测方法。特异性结果显示,该方法对猪流行性腹泻病毒、牛冠状病毒、犬冠状病毒、水貂冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应,表明该方法的特异性良好。敏感性结果显示,该方法的最低检测量为3.69×10⁴拷贝/μL,高于普通PCR最低检测量10倍,表明该方法的敏感性良好。使用建立的方法对3份临床样品进行检测,该方法与普通PCR方法结果一致,10倍稀释样品后,NanoPCR相比较普通PCR条带仍然具有较高辨识度。综上,本研究建立的灵敏、特异的NanoPCR方法可以对临床样品进行快速诊断和鉴定。     

南方养殖草鱼呼肠孤病毒的分子特性比较及双重PCR检测方法的建立

本实验室2009年从广东省患典型出血病的养殖草鱼中分离到一株具强致病性的水生呼肠孤病毒GCRV-GD108株,该毒株具有11个节段双链RNA。全基因组序列分析显示与草鱼呼肠孤病毒GCRV及水生呼肠孤病毒属其它已知种存在较大的分子差异。本研究进一步检测了广东、福建、湖南等地草鱼出血病流行毒株的分子特性。根据已克隆到的GCRV-GD108株11个节段序列分别设计合成特异引物,从各地收集患出血病草鱼,提取组织总RNA,RT-PCR检测。结果表明各检测样品均可扩增到特异性条带,而GCRV标准株则无特异条带;同时根据GCRV标准株序列合成的特异引物进行扩增,GCRV标准株有特异性条带,而各检测样品则均无带。测序结果显示各样品间相应片段序列的同源性很高(95.2%~99.4%),与GCRV-GD108的相应序列也具高同源性(95.0%~99.8%),说明检测样品与GCRV-GD108株具有相似的分子特性,均与GCRV及水生呼肠孤病毒属的其它种存在较大差异。本研究结果提示我国养殖草鱼出血病病毒存在着不同的分子类型,GCRV-GD108株在南方具有一定的代表性,在病害防控上尤其是疫苗研制与使用上应予关注。此外,从上述引物中筛选出适合于双重PCR的引物对,建立了双重PCR检测方法,可在一次PCR反应中鉴别所感染的病毒属于GCRV或GCRV-GD108株。     

抗体Fc片段特异寡核苷酸配基介导的实时定量免疫PCR

目的:利用小鼠IgG抗体Fc片段高特异、高亲和寡核苷酸配基,构建实时定量免疫PCR检测方法,提高抗体检测的灵敏度。方法:用SELEX技术从随机寡核苷酸文库中筛选抗体Fc片段特异寡核苷酸配基,设计合成信标序列,通过不对称PCR法,制备IgG Fc片段的核酸信标配基分子;32P标记核酸信标配基,采用琼脂糖凝胶阻滞双显色法鉴定核酸信标配基与IgG Fc片段结合的亲和力和特异性;制备IgG Fc特异性寡核苷酸信标配基-抗体复合检测分子,构建小鼠IgG Fc片段特异核酸信标配基介导的实时定量免疫PCR检测方法。结果:制备了IgG Fc片段的核酸信标配基分子;凝胶阻滞放射自显影和考马斯亮蓝二次染色结果显示该核酸信标配基分子与IgG Fc片段具有高度亲和力和活性,而且只与非变性IgG结合,与变性IgG不结合;IgG Fc片段的特异核酸信标配基与IgG结合形成复合检测分子,有效完成了信号传递和实时定量PCR信号放大过程。结论:初步建立了一种全新的核酸信标配基介导的免疫PCR检测方法,可有效提高现有IgG类抗体免疫检测的灵敏度和特异性。     

应用实时定量PCR技术研究人重组干扰素α2b在人群中对麻疹病毒和风疹病毒的抑制作用

麻疹病毒(measles virus)是一种导致麻疹的副粘病毒科麻疹病毒属的单股负链RNA病毒.麻疹是儿童最常见的一种急性呼吸道传染病.临床上以发热、上呼吸道炎症、结膜炎、口腔粘膜斑及全身丘疹为特征[1].风疹病毒(rubella virus,RUV)属于披膜病毒科风疹病毒属.孕妇特别是怀孕3个月以内的孕妇感染风疹病毒后,可以引起胎儿畸形.麻疹病毒和风疹病毒的实验室检测包括病毒分离、病毒特异性IgM的检测、分子杂交直接检测病毒RNA、RT-PCR、RT-nested PCR(RT-nPCR)等[2-3].     

GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒

本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT-PCR检测方法,该方法可以同时检测12种呼吸道病毒,包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒。针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物,分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性。多重检测体系在10~3拷贝/μL水平可同时检测到12种病毒。另检测24份临床标本,以real-time RT-PCR为参考标准,进一步验证检测体系。结果表明,这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强,可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒。     

荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

荧光定量PCR技术是近些年来发展起来的一种核酸检测技术,它以灵敏度高、特异性强、重复性好、快速准确定量等特点被广泛应用于各个领域。现主要介绍荧光定量PCR技术在病毒、细菌、真菌和寄生虫4个临床微生物检测方面的应用进展。     

环介导间接PCR检测方法的建立

建立环介导间接PCR检测体系,为分子诊断提供一种新的检测工具。以质粒pUC18的核苷酸序列为模板,设计两条特异性探针,采用常规PCR技术将特异性探针标记于大豆Lectin基因的左右两端充当报告基因,此标记的报告基因与待检的pUC18质粒经杂交和缺口补平后形成一环状DNA分子,然后采用反向PCR技术扩增报告基因,建立针对pUC18质粒的环介导间接PCR检测方法。结果表明,该检测方法的检测底限为0.32 pg/μL,与常规PCR相当,并且与其他质粒和动物DNA检测无交叉反应,是一种简单、快速、灵敏、特异的PCR检测方法。     

Ⅱ型猪圆环病毒PCR检测方法的建立及试剂盒的研制

根据Cenbank上已发表的Ⅱ型猪圆环病毒（PCV-2）的基因序列,设计并合成一对能特异性扩增Ⅱ型猪圆环病毒的引物,通过对PCR方法的优化,建立了PCR方法检测PCV-2并研制出试剂盒。然后对试剂盒的敏感性、特异性和有效期进行了研究。结果表明,该试剂盒具有很好的特异性和敏感性,有效期在-20℃至少可以保存一年。     

埃博拉病毒莱斯顿亚型实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究的目的为建立一种灵敏、快速、定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。首先选择埃博拉病毒莱斯顿亚型的保守基因NP基因作为检测靶目标,筛选出保守序列并设计合成一对特异性引物。然后将连有NP全长基因的重组质粒作为定量标准品,将10倍系列稀释的重组质粒进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、灵敏度及特异性检测。结果显示建立的埃博拉病毒莱斯顿亚型荧光定量PCR检测方法,其灵敏度可达102拷贝/μL,不同梯度标准品间线性关系(R2)达0.997,斜率为-0.3101,扩增效率为110.145%,所有标准品均在79.94℃出现尖且窄的特异性熔解峰。利用该检测系统可以快速定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸,灵敏度高、重复性好,可用于基础及临床实验室对埃博拉病毒莱斯顿亚型感染的快速诊断和临床效果的监测,具有实际的应用价值。     

滚环复制技术的建立及在RNA病毒基因检测中的初步应用

滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基因复制方式,这种方式可使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增。本文中用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针,分别进行了1份细胞培养的禽流感病毒H5N1亚型样品、1份细胞培养的SARS病毒样品和4份丙型肝炎病毒阳性血清样品的检测。检测原理是探针与靶序列杂交后便可在T4DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子,该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增。本文还利用按禽流感病毒NA1基因区序列合成的模拟DNA分子对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示：利用固相RCA技术成功检测到三种RNA病毒的基因,该方法的灵敏度可达到能检测10^3拷贝模式DNA分子的水平。与传统的PCR方法敏感性的比较尚待进一步研究。