石榴种皮木质素合成相关转录因子基因PgMYB的克隆与表达

为初步探讨石榴(Punica granatum L.)籽粒硬度产生机理及转录因子基因PgMYB在石榴种皮木质素生物合成途径中的作用,测定了不同石榴品种籽粒硬度及种皮总木质素含量并分析两者关系,利用RT-PCR结合RACE技术,克隆了‘红玉石籽’石榴的1个MYB转录因子基因(PgMYB),通过实时荧光定量PCR技术分析了PgMYB的相对表达量。结果表明:(1)石榴籽粒硬度与种皮总木质素含量呈显著正相关关系,相关系数为0.906。(2)PgMYB基因cDNA全长1 088bp,开放阅读框921bp,编码蛋白由306个氨基酸组成,N端具有2个MYB DNA结合结构域,是植物中一个典型的R2R3-MYB转录因子;同源分析显示,该基因编码的氨基酸序列与银合欢的MYB1和拟南芥的MYB4一致性分别高达89%和84%。(3)在不同籽粒硬度石榴品种中PgMYB的表达与籽粒硬度和种皮总木质素含量呈负相关关系。(4)在石榴各个发育时期中,PgMYB表达与种皮总木质素含量同样呈负相关关系。推测该基因可能抑制石榴种皮总木质素的生物合成。     

石榴赤霉素合成相关基因PgKO的克隆及表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatum cv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术,从石榴花中克隆得到赤霉素合成关键酶——内根贝壳杉烯氧化酶(KO)基因,命名为PgKO(GenBank登录号为MG208017)。PgKO全长cDNA为1 729bp,包含1 542bp开放阅读框(ORF),编码513个氨基酸,相对分子量为141.16kD,理论等电点为4.9。多重序列对比显示,PgKO与苹果MdKO、白梨PcKO、葡萄VvKO的相似性分别为61.28%、64.56%和73%,并且具有CYP450结构域(脯氨酸富含域、氧还原位点和血红素结合域)。系统进化树分析表明,PgKO与其他物种的起源相同,并与桉树EgKO的亲缘关系最近。荧光定量PCR发现,在石榴蕾期和盛花期,PgKO基因的表达量均为筒状花高于钟状花,且PgKO基因在两种花型的子房、花药、花萼中均有表达,但筒状花中子房的表达量最高,花萼的表达量最低;钟状花中花药的表达量最高,子房的表达量最低。     

油茶DELLA基因的克隆和表达分析

为了解油茶(Camellia oleifera)中DELLA基因功能及其表达特性,采用PCR技术从‘长林4号’油茶中克隆了5个DELLA基因,命名为CoDELLA1~CoDELLA5,对其编码的5个CoDELLA蛋白进行生物信息学分析,并对5个DELLA基因的表达模式以及激素响应活性进行了分析。结果表明,5个CoDELLA基因的编码区长度分别为1 791、1 875、1 848、1 593和1 581 bp,分别编码597、625、616、531和527个氨基酸。5个CoDELLA蛋白的氨基酸序列相似度较高,丝氨酸残基为主要的潜在磷酸化位点,CoDELLA蛋白N端均含有典型的DELLA结构域。不同物种中DELLA蛋白的系统发育存在差异,CoDELLA与茶树的CsDELLA同源性最高。CoDELLA基因在油茶不同组织中的表达也存在差异,且赤霉素和独脚金内酯等多种激素和非生物胁迫对其表达具有调控作用。CoDELLA基因可能在油茶的生长发育和非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

甘蓝型油菜BnFLA基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从甘蓝型油菜中获得了1个类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(FLA),命名为BnFLA。BnFLA基因开放阅读框长为1 200bp,编码399个氨基酸,分子量为42 885.9Da,等电点为6.37。预测的BnFLA蛋白包含N-端信号肽、2个AGP-like结构域、2个fasciclin-like结构域和C-端GPI-anchor序列。系统进化分析表明BnFLA氨基酸序列与BrFLA17和AtFLA2进化关系较近,一致性分别为98%和87%。qRT-PCR分析表明,BnFLA基因在油菜各组织均有表达,并以下胚轴中表达量最高,其次为子叶,茎秆中表达最少;BnFLA基因的表达受到GA3、BR、IAA、ABA和NaCl的诱导,但受6-BA、蔗糖、低温和PEG抑制。研究认为,油菜中BnFLA基因可能参与激素信号转导途径和非生物胁迫应答。     

麻竹同源异型盒基因DlKNOX的克隆及表达分析

为探讨同源异型盒(KNOX)基因在麻竹(Dendrocalamus latiflorus)茎秆发育中的作用,采用RT-PCR和RACE技术,从其幼茎中克隆了1个KNOX同源基因,命名为Dl KNOX,其c DNA序列全长为1511 bp,包含5′UTR 196 bp、3′UTR 238 bp和编码区1077 bp。该基因编码含358氨基酸的蛋白,具有KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN等4个保守结构域,符合KNOX家族的特征,属于I类蛋白。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OSH1的一致性最高(86%)。组织表达特异性分析表明,Dl KNOX在节部的表达丰度最高,其次为幼茎,根中最低。Dl KNOX基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中经诱导表达,获得1条分子量约为82 k Da的重组蛋白,与预期的重组蛋白分子量一致(包含了MBP标签蛋白42.5 k Da和Dl KNOX蛋白39.5 k Da)。该基因在大肠杆菌中的最适表达条件为28℃,0.3 mmol L–1 IPTG诱导2 h。这为进一步研究Dl KNOX在麻竹茎秆发育中的功能奠定了基础。     

石榴PgGPX基因克隆及盐胁迫下的表达分析

该研究以‘红玉石籽’籽粒为材料,通过RACE技术克隆了石榴GPX基因,利用Real-time PCR检测石榴在不同器官中及石榴叶片在盐胁迫处理下的相对表达量。结果表明:(1)PgGPX基因cDNA全长872bp,其中开放阅读框504bp,编码168个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白具有植物GPX的典型结构,与可可树、荔枝、甜橙、玉米等植物的GPX基因相比,具有较高的一致性,分别为90.30%、87.40%、86.80%、86.20%。(2)PgGPX在石榴的叶片、花瓣和籽粒中均有所表达,且具有组织特异性,在盐胁迫下,石榴叶片中的PgGPX表达量显著上升。推测PgGPX基因在胁迫反应中可能发挥重要作用。     

茶树CsCCD1和CsCCD4基因的克隆和表达分析

该研究以‘铁观音’茶树为材料,同源克隆了茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CsCCD1和CsCCD4 (NCBI登录号分别为MH119136和MH119137)全长cDNA。序列分析结果显示,CsCCD1序列全长1 766 bp,包含1 641 bp开放阅读框(ORF),编码545个氨基酸,定位于细胞质中,不存在跨膜结构和信号肽;CsCCD4序列全长1 942 bp,包含1 842 bp ORF,编码612个氨基酸,不存在跨膜结构,但在N端具有叶绿体转运肽,定位于质体中。进化树分析显示,CsCCD1和CsCCD4与杜鹃聚为一类。荧光定量检测显示,CsCCD1和CsCCD4在叶、茎和花中表达量较高。在乌龙茶做青过程中,CsCCD1和CsCCD4基因都是从鲜叶到晒青表达量下调,而CsCCD1在一摇和二摇显著上调表达,在三摇后下降;CsCCD4只在一摇后上调表达,之后表达量迅速降低。推测CsCCD1和CsCCD4基因可能与乌龙茶做青香气品质形成关系密切。     

小麦TaWRKY47基因的克隆与表达分析

为了探究小麦WRKY基因的功能,该研究采用RT PCR方法,在小麦叶片组织中克隆WRKY基因,并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明：(1)成功克隆得到1个小麦WRKY基因,命名为TaWRKY47。(2)TaWRKY47基因开放阅读框长度为900 bp,编码299个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域和一个C₂HC锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅲ类成员。(3)亚细胞定位分析结果显示,TaWRKY47蛋白定位于细胞核。(4)荧光定量PCR结果表明,TaWRKY47基因在小麦根、茎、叶、雄蕊和雌蕊中均有表达,其中在雌蕊中表达量最高,且受低温、干旱、盐、ABA和H₂O₂等胁迫表达增强,推测TaWRKY47基因参与了小麦的逆境胁迫过程。该研究结果为进一步研究TaWRKY47基因功能与抗逆机制奠定了理论基础。     

麻竹miR172a靶基因DlAP2的克隆及其表达

为了解开花麻竹(Dendrocalamus latiflorus)的Dl AP2基因功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆了mi R172a靶基因AP2同源序列c DNA全长,命名为Dl AP2。结果表明,Dl AP2基因c DNA全长为1729 bp,包含5′端非编码区81 bp、开放阅读框1464 bp、3′端非编码区160 bp和24个碱基的Poly A尾巴,在编码框靠近3′端130 bp处有1个高度匹配mi R172a的结合位点(CTGCAGCATCATCAGGATTCT)。Dl AP2编码487个氨基酸的蛋白,具有两个AP2结构域,属于AP2/ERF家族AP2亚家族的AP2组,与来自其它单子叶植物的AP2蛋白均有较高同源性。RLM-5′RACE分析表明,mi R172a主要在靶序列的第11~12个碱基之间剪切靶基因Dl AP2的mi RNA。q RT-PCR结果表明,麻竹花芽中Dl AP2基因的表达规律与mi R172a表达变化正好相反,证明mi R172a对Dl AP2基因的表达具有调控作用。     

石榴木质素合成相关基因PgMYB308的克隆和表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatumcv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,获得与木质素的合成相关基因PgMYB308。PgMYB308基因cDNA全长792bp,编码263个氨基酸。分子量为29.56kD,理论等电点为9.07。序列比对和功能域分析发现,PgMYB308包含R2和R3保守域,以及C1、C2、C4和锌指基序。系统进化树分析显示,PgMYB308与其他物种起源相同,而与桉树EgMYB308亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,PgMYB308在茎、叶和种子等组织中均有表达,其中茎中表达量最高,叶片中表达量最低;PgMYB308在‘突尼斯软籽’中表达最高,而在‘红玉石籽’和‘白玉石籽’中表达量较低;PgMYB308在‘红玉石籽’籽粒的不同时期均有表达,但在花后20d相对表达量最高,以后随发育进程呈现逐渐下降的趋势。     

巨桉BRI1基因的克隆和表达分析

为了解BRI1基因在巨桉中的功能,采用PCR技术克隆了EgrBRI1基因,分析了EgrBRI1的生物信息学和亚细胞定位,并对EgrBRI1基因响应激素和胁迫的差异表达进行了分析。结果表明,EgrBRI1基因全长3 893 bp,编码1 197个氨基酸。EgrBRI1蛋白稳定,空间结构复杂,存在3个motifs,主要定位于细胞膜。茉莉酸甲酯和油菜素内酯(BR)处理后,EgrBRI1基因在叶片中的表达上升,而水杨酸处理则没有明显的变化。盐胁迫和冷胁迫下,EgrBRI1基因表达表现为先下降后上升的趋势。因此,EgrBRI1基因能快速对外施激素做出响应,并在巨桉抗逆方面发挥重要作用,这可能是通过对BR信号的响应来实现的。     

穿龙薯蓣DnSQS基因的克隆及表达分析

角鲨烯合成酶(SQS)是植物甾醇和萜类化合物合成的关键酶之一。为了揭示穿龙薯蓣SQS基因的功能,该研究以穿龙薯蓣cDNA为模板,采用PCR方法克隆DnSQS基因,并对得到的序列进行生物信息学分析。采用HPLC方法检测不同组织的薯蓣皂苷元含量,采用实时荧光定量PCR技术分析DnSQS基因在不同组织、激素诱导及非生物胁迫下的表达特征。结果表明：(1)成功克隆得到穿龙薯蓣2个基因DnSQS1与DnSQS2,二者分别编码409和433个氨基酸,但编码的蛋白二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,都存在由α螺旋折叠形成的保守催化中心以及2个富含天冬氨酸的功能结构,都具有2个跨膜螺旋结构,并且都定位于内质网。(2)DnSQS1和DnSQS2与盾叶薯蓣DzSQS的亲缘关系较近,2个DnSQS蛋白在进化上相对保守。(3)不同组织的薯蓣皂苷元含量存在差异,其含量大小依次为叶>根状茎>地上茎>根;DnSQS1与DnSQS2基因在不同组织中的表达也具有显著差异,其中DnSQS1在地上茎中表达水平最高,DnSQS2在叶中表达水平最高。(4)以激素MeJA、ABA、SA、Eth及非生物胁迫H     

丹参SmVS基因的克隆和表达分析

为了解丹参(Salvia miltiorrhiza)的Vinorine合成酶基因(VS)的功能,从丹参中克隆了SmVS基因,并通过Ex PASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析,同时利用RT-qPCR技术分析其表达模式。结果表明,SmVS基因全长726 bp,编码241个氨基酸,编码蛋白分子量为26 861.72,等电点PI为5.66,为膜外蛋白,推测定位于线粒体。系统进化分析表明,丹参SmVS与野生油橄榄(Olea europaea var. sylvestris)的VS亲缘关系较近。SmVS基因在丹参根中的表达比叶的高,叶中的转录水平在21:00最高。因此,推测SmVS基因与光应答有关。     

巨桉EgrGBF1基因的克隆和表达模式分析

G-box结合蛋白(GBF)是一类能够识别并结合G-box的转录因子,广泛参与植物基因响应外界刺激的表达调控。通过巨桉(Eucalyptus grandis)初生生长到次生生长的转录组测序筛选出差异表达基因EgrGBF1,为探讨其在桉树生长发育中的功能,从巨桉中克隆了该基因,并进行了结构和进化分析。结果表明,EgrGBF1编码区长度为984 bp,编码327个氨基酸, 存在2个转录本,分别命名为EgrGBF1α和EgrGBF1β。实时荧光定量PCR结果表明,EgrGBF1α和EgrGBF1β在不同组织中,不同激素、胁迫处理下的表达模式不同,EgrGBF1α主要在茎尖表达,沿节间向下表达量逐渐降低,而EgrGBF1β在韧皮部高表达,在节间的表达量无显著差异。在水杨酸和缺硼处理下,EgrGBF1α和EgrGBF1β的表达趋势相反。EgrGBF1α在缺磷处理168 h的表达量最高,而EgrGBF1β在处理6 h的表达量最高。因此,EgrGBF1在桉树生长发育以及响应胁迫中发挥着重要作用,且转录本EgrGBF1α和EgrGBF1β可能具有不同的功能。     

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。     

橄榄CaICE1基因的克隆和表达分析

为了解橄榄(Canarium album)抗寒相关转录因子ICE1的调控功能,采用RT-PCR技术克隆了‘福榄1号’的ICE1,命名为CaICE1,并进行生物信息学、qRT-PCR表达模式和相关miRNA预测分析。结果表明,CaICE1 cDNA序列的开放阅读框长度为1 650 bp,可编码549个氨基酸(GenBank登录号MG459422)。Ca ICE1为不稳定亲水性蛋白质,含有跨膜结构、磷酸化位点以及HLH保守结构域,定位于细胞核,与枳的ICE1亲缘关系较近。CaICE1密码子偏好性较弱,AGA、AGG、TGG和CCA可能为其最优密码子群。CaICE1主要在橄榄花、种子和叶中大量表达,-3℃低温胁迫下CaICE1表达水平比常温显著上升。psRNAtarget预测结果表明,CaICE1可能是miR825、miR477、miR5658、miR1436和miR394等多个逆境响应miRNA的靶基因。因此,CaICE1可能在橄榄低温胁迫过程中发挥重要调控作用,且可能受miRNA的调控。     

抱茎独行菜MUM4基因的克隆及分析

抱茎独行菜(Lepidium perfoliatum L.)为十字花科具典型粘液繁殖体植物,为探究该植物中种皮粘液质基因（MUCILAGE-MODIFIED4,MUM4,该基因在拟南芥中编码NDP-L-鼠李糖合成酶)的功能,通过生物信息学分析设计引物克隆得到抱茎独行菜MUM4基因,命名为LpMUM4。同源比对分析结果表明,LpMUM4与拟南芥AtMUM4基因具有很高的一致性。qRT-PCR结果表明,该基因在抱茎独行菜各组织中均有表达,在角果和根中的表达量最高,且其表达量随角果的发育表现出渐强的趋势。免疫组织化学定位分析表明,LpMUM4基因于角果发育的早期阶段在内珠被和外珠被都有表达,而在外珠被的表皮和亚表皮中表达量更高,至角果发育的最后阶段,其表达集中于表皮和亚表皮层,这可能与抱茎独行菜的外珠被发育成种皮及粘液质的生成有关。将LpMUM4基因转化拟南芥,该基因的过表达对位于粘液质合成途径中的上游基因AtTTG1具有显著的抑制作用。表型比对观察显示,转基因拟南芥与其野生型植株形态无显著差异,这可能是因为抱茎独行菜种皮的发育和粘液质的形成是一个多基因调控的复杂过程,某一基因的过表达或许不会引起明显的表型变化。     

唐菖蒲赤霉素受体基因克隆及表达分析

以唐菖蒲子球为材料,采用RT PCR技术,克隆了1个赤霉素（GA）受体基因,命名为GhGID1a（GenBank登录号为KU525107）。其开放阅读框为1 032 bp,编码343个氨基酸。序列比对结果表明,GhGID1a推导氨基酸序列与百子莲、油棕和海枣等植物的GID1的氨基酸序列相似性较高,分别为82%、78%和77%。50 mg/L GA₃对子球萌发具有促进作用,150 mg/L GA₃会抑制其萌发。实时荧光定量PCR结果显示,GA3处理对GhGID1a基因表达具有反馈抑制作用,GhGID1a表达量随着子球休眠解除而逐渐降低,推测唐菖蒲子球休眠解除可能与GA及其受体基因有关,GA及其受体基因GhGID1a可能参与了调控唐菖蒲的子球休眠与萌发过程。