核糖体展示技术的研究与应用现状

核糖体展示技术是20世纪90年代建立并发展起来的一种完全在体外进行的分子筛选与进化技术,避免了体内展示技术的缺陷,不受细胞转染与基因表达等因素影响,已经成功用于筛选与靶分子特异结合的高亲和力多肽、抗体和酶等.本文主要概述了核糖体展示技术的基本原理、具体步骤、技术改进及应用现状.     

体外展示技术及其在抗体工程中的应用

体外展示技术包括核糖体展示技术、mRNA展示技术、DNA展示技术,是在无细胞蛋白质表达体系内将基因型和表型通过一定的方法连接在一起,体外高通量的筛选多肽和蛋白质的技术。抗体的产生是一个不断选择的过程,利用体外展示技术在体外选择针对某一抗原的抗体分子,并结合基因工程技术对抗体进行改造,以产生高亲和力、高特异性的抗体。体外展示技术的研究和应用已越来越广泛,有望成为下一代的抗体制备技术。     

文库筛选与分子进化的核糖体展示新方法

利用适当的文库筛选技术快速、简便地从DNA文库、随机肽库、抗体库或其它蛋白文库中筛选生物活性物质是目前分子生物学研究的一个热点.核糖体展示是一种完全离体进行的功能蛋白筛选和进化鉴定的新技术,避免了传统的活体筛选技术的缺陷,使得文库容量增大、分子多样性加强.本文系统地评述了核糖体展示技术在制备ScFv单链抗体方面的应用,包括ScFv单链抗体模板的构建、体外转录与体外翻译、亲和筛选及筛选效率的测定以及分子多样性和体外进化研究,讨论了核糖体展示技术目前的发展动态、存在问题及发展趋势.     

核糖体展示技术

组合化学在分子生物学中的应用,大大提高了所构建分子文库的容量,而高通量筛选技术对于大容量文库的筛选是至关重要的。核糖体展示技术克服了传统筛选技术库容量小和筛选效率低等缺陷。该技术完全在体外进行,其文库容量不受细胞转染效率的影响,库容量和筛选效率得到很大提高,可与其他技术相组合,在体外分子高效表达和定向进化方面具有广泛的应用前景。该文介绍核糖体展示技术的基本原理、技术特点以及最新研究进展。     

mRNA展示技术

mRNA展示技术是一种新兴的体外筛选多肽和蛋白质的有力工具.在筛选过程中,mRNA与其编码的多肽或蛋白质共价结合,形成mRNA-蛋白质融合体,能在大容量的多肽文库(1013～1015)中筛选具有特定生物学功能的多肽和蛋白质.目前,mRNA展示技术主要应用于各种靶分子的多肽和蛋白质适体的发现以及蛋白质相互作用机制的阐明和分析.由于其自身的巨大发展潜力,mRNA展示技术具有更为广阔的应用前景.     

核糖体展示及体外分子选择与进化

核糖体展示是20世纪90年代中期发展起来的一种简便而有效的体外分子选择与进化技术。它也是第一种完全在体外进行蛋白质或多肽分子选择与进化的方法。本主要概述了体外核糖体展示技术的建立基础、基本原理和技术特点等,并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。     

利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法的建立

核糖体展示(ribosomedisplay)是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具.利用体外转录和翻译偶联系统可以方便而快捷地完成核糖体展示.筛选系统利用一对能够紧密结合的蛋白质:人锚蛋白(ankyrin)和红血球膜带3蛋白细胞质区域(cytoplasmicdomainoferythrocytemembraneproteinBand3,Cdb3)作为模式分子,希望利用cdb3蛋白通过核糖体展示亲和选择得到锚蛋白基因.用于核糖体展示的人锚蛋白基因结构由组装PCR构建,通过PCR技术引入核糖体展示所需的结构元件.在亲和筛选步骤后,只能利用红血球膜带3蛋白筛选得到锚蛋白基因,而不能利用对照牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)筛选得到,从而说明建立的核糖体展示技术能够正常发挥作用.     

分子文库展示技术

分子文库展示技术是一系列广泛应用于多肽、蛋白质及药物筛选和研究蛋白质间相互作用的有效的生物学技术。它将组合成的具有一定长度的随机序列寡核苷酸片段(或cDNA)克隆到特定表达载体中,使其表达产物(多肽片段或蛋白质结构域)以融合蛋白的形式展示在活的噬菌体或细胞表面。根据其蛋白质表达是否依赖于宿主表达系统,分为体内表达展示系统和无细胞展示系统(体外表达展示系统)。就其展示的部位不同又可分为噬菌体展示技术、细胞表面展示技术、核糖体展示技术、mRNA展示技术等。现对各种展示技术的基本原理及相关应用做简要综述。     

运用 mRNA 体外展示技术筛选胸苷酸合成酶 RNA 亲和肽

以体外选择方法筛选不同功能的核酸、肽和蛋白质是近年的研究热点, mRNA 体外展示是一种新兴的高效多肽选择技术,其基本原理是通过含嘌呤霉素寡核苷酸的 Linker 使 mRNA 与它编码的肽或蛋白质共价结合,形成 mRNA- 蛋白质融合体,这一方法已用于多种功能肽的鉴定 . 以 mRNA 体外展示技术进行了由大容量多肽库中 (>1013) 筛选胸苷酸合成酶 (thymidylate synthase , TS) RNA 亲和肽的研究,通过精密的实验设计,建立了一套完整有效的筛选方法,并对实验条件进行了优化 . 已进行了 8 轮筛选,结果表明,以 mRNA 体外展示技术获得的多肽分子,可以与 TS mRNA 亲和 . 将测序结果与初始肽库进行比较,发现亲和肽中碱性氨基酸及芳香族氨基酸含量明显增加,说明其在与 RNA 结合中具有重要作用 . mRNA 展示技术作为一种大容量文库的体外筛选方法,将广泛应用于与固定化靶物质具高度亲和性及特异性的多肽和蛋白质的筛选 .     

抗体库的起源、发展及应用前景

抗体是高等动物特异性免疫应答反应所产生的免疫球蛋白,负责特异抗原的识别和清除。抗体不仅是机体抵抗病原体入侵的强大武器,也是基础科学研究中用于特异性分子识别的专用工具。抗体分子的多样性导致了抗体库概念的产生,让我们认识到每个高等生物个体都是一个天然的抗体库。在后基因组时代,为了适应各种“组学”研究,特别是为了蛋白质组学研究的高通量技术需求,在噬菌体展示技术平台的基础上,构建了各种基因工程抗体库和抗体替代物库。但现在越来越多的其他展示技术如核糖体展示、mRNA展示等体外展示技术也被用于抗体库的研究,而且表现出了相比于噬菌体展示更多的优势。以下根据目前最新发表的有关综述文章和研究论文,对抗体库的起源、发展及应用前景给予粗略的描述,为读者提供最新的参考文献,通过分析目前存在的问题,论述了抗体库技术的应用前景和发展趋势。