蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达

目的:通过在原核表达系统中表达蓖麻的可溶性脂肪酸去饱和酶基因和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶基因,为脂肪酸去饱和酶序列结构与功能的研究奠定基础。方法:将蓖麻RCD△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶基因亚克隆到大肠杆菌BL21表达载体pET32a+中,获得重组表达载体pET32a+-R9,pET32a+- F1,并通过SDS-PAGE和Western Blotting鉴定蛋白的表达情况。结果:经PCR和测序鉴定,证实两个重组质粒含有目的基因片段;SDS-PAGE和Western Blotting证实两种蛋白在大肠杆菌中获得表达,但表达量具有明显的不同;Anthepro软件对蛋白跨膜结构的分析,验证蓖麻△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶在结构上的不同。结论:蓖麻的RCD脂肪酸去饱和酶和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶都得到了表达,但线虫fat-1脂肪酸去饱和酶表达量偏低;这可能与fat-1脂肪酸去饱和酶是一类跨膜蛋白的性质直接相关。因此,对于线虫fat-1脂肪酸去饱和酶的基于蛋白纯化的结构分析有待进一步的研究。     

鸡氨肽酶N的高效可溶性表达及生物学功能分析

本研究旨为克隆鸡氨肽酶N(chAPN)基因,高效表达可溶性目的蛋白,并测定其生物学功能。应用RT-PCR方法从鸡胚肾细胞中克隆chAPN的基因片段,经测序鉴定后再克隆至原核表达载体pCOLD-TF,构建重组原核表达质粒pCOLD-TF-chAPN,在大肠杆菌BL21(DE3)中经不同条件诱导表达目的蛋白;利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;Leu-PNA酶促反应和ELISA等方法检测目的蛋白生物学功能。结果显示,重组质粒pCOLD-TF-chAPN在大肠杆菌中以可溶形式高效表达;酶促反应及ELISA结果显示该蛋白具有酶活性,可结合传染性支气管炎病毒(IBV),并表现为剂量依赖性。这为今后研究chAPN的酶活性、作为IBV受体及抗病毒功能奠定了实验基础。     

HCV丝氨酸蛋白酶小分子底物构建及GST融合表达

丝氨酸蛋白酶是丙型肝炎病毒重要的功能蛋白和药物作用靶点,其通过分子内（cis）和分子间（trans）方式催化水解前体蛋白,释放病毒功能蛋白。目的：为深入研究病毒蛋白酶活性和抑制剂鉴定需要,实验研究参照丙型肝炎病毒1a亚型菌株蛋白酶天然底物的氨基酸序列特点,设计了一段包含两个天然底物酶切位点的小分子多肽2S,并进行了原核表达。方法：利用PCR方法,合成2S小分子多肽基因,目的基因两端引入BamH I和EcoR I两个限制性酶切位点,双酶切后将基因与表达载体pGEX-4T-2重组,转化大肠杆菌DH5α,经化学诱导进行GST融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化的GST 2S融合蛋白在体外反应系统进行酶切鉴定,SDS-PAGE和ELISA鉴定酶切结果。结果：PCR合成的小分子底物多肽2S基因,经与表达载体重组后测序,证实基因序列正确。采用0.5mmol/L浓度的IPTG诱导工程菌过夜,获得表达的目的蛋白,经分离纯化得到融合蛋白GST-2S。GST-2S在体外磷酸盐缓冲系统中与丝氨酸蛋白酶反应,15%SDS-PAGE鉴定酶切产物,证实融合蛋白底物条带明显消失,ELISA结果同样说明融合蛋白的底物活性。结论：含有两个天然底物酶切位点的小分子多肽可以替代病毒天然底物,实验结果为丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶活性研究和酶抑制剂研究奠定了方法学基础。     

圆红冬孢酵母新颖脂肪酸合酶的重组表达、纯化与活性检测

脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FAS)催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A反应生成脂肪酸,是油脂合成代谢途径中最重要的酶之一。在高产油脂的圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides中发现了一种新颖的FAS,它含两个亚基,与其他物种的FAS相比,具有独特的结构域组成,尤其是含两个酰基载体蛋白(ACP)结构域。由于ACP在脂肪酸合成反应中起辅因子作用,推测多个ACP有利于提高FAS的催化活性,为研究该FAS的生物化学和结构特征,构建了表达FAS两个亚基的载体,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),含pET22b-FAS1和pET24-FAS2质粒的重组菌株ZWE06可同时高表达两个亚基,经硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心和阴离子交换层析纯化,得到的重组FAS比活力达到548 mU/mg。纯化的FAS复合物可用于后续酶动力学和蛋白结构研究,且表达与纯化方法的建立对研究其他ACP的功能具有参考价值。     

人鼻咽癌相关基因NGX6在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

NGX6是一个新克隆的鼻咽癌抑瘤基因候选者,为了进一步制备抗NGX6编码蛋白质的抗体和研究它的功能,本研究拟在原核表达系统中表达并纯化出NGX6蛋白．采用多聚酶链式反应(PCR)方法扩增出NGX6基因蛋白编码序列,构建该基因的融合表达质粒pGEX3X/NGX6,导入大肠杆菌中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳．Western hlot鉴定．用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白．结果显示构建的融合表达质粒酶切和测序鉴定阅读框架正确,导入大肠杆菌中诱导后出现一条42kDa的新蛋白带,主要存在于细菌沉淀中,占总蛋白的26％,Western blot鉴定其为GST/NGX6融合蛋白,并进一步纯化出融合蛋白．研究表明NGX6基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达,并能纯化出该种蛋白,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下了基础．     

探索大肠杆菌细胞膜合成过程中脂肪酸的掺入模式

【目的】探索大肠杆菌生长分裂过程中,脂肪酸作为底物在细胞膜合成过程中的掺入模式。【方法】本研究解析了以乙酰CoA为底物,合成中间产物长链脂酰-ACP,随后合成磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)的途径,并将合成途径中的10个关键酶与绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)或红色荧光蛋白(monmer Cherry,mCherry)进行融合,在大肠杆菌内表达这些融合蛋白,用激光共聚焦荧光显微镜成像的方式来获得这些融合蛋白的定位信息。【结果】宽场荧光显微镜成像结果显示,磷脂酰乙醇胺合成途径中的10个酶在不同表达水平下出现不同的定位模式。在大肠杆菌中高水平表达融合蛋白EGFP-FabA、EGFP-FabB、EGFP-FabI、EGFP-FabG、EGFP-PlsB和EGFP-PssA时,细胞两极和中部有大量蛋白聚集的现象。EGFP-FabD、EGFP-FabF、EGFP-CdsA、EGFP-PSD在不同表达水平下,均匀分散在细胞质或细胞膜上。缩时影像(Time-lapse)结果显示,合成途径中的一个关键蛋白EGFP-Pls B在细胞分裂前随着细胞膜的内陷聚集到细胞隔膜,随着细胞分裂,母细胞的隔膜成为新细胞的两极。【结论】本研究通过获取磷脂酰乙醇胺合成相关蛋白酶在大肠杆菌中的定位结果,推测脂肪酸分子是在细胞分裂隔膜和两极掺入,被催化合成PE后被运送到细胞膜其他位置。     

融合酰基载体蛋白可增强大肠杆菌重组蛋白的可溶性和热稳定性

目前,蛋白质可溶性和热稳定性已成为重组蛋白高效生产、功能应用和长久保存不可回避的问题,而使用酸性蛋白融合标签可能是其有效解决策略。酰基载体蛋白(ACP)是脂肪酸生物合成途径的必要组分,在大肠杆菌中为一个高度酸性的小分子多肽。将大肠杆菌ACP与几个热不稳定的靶蛋白[如小桐子抗坏血酸过氧化物酶1(Jc APX1)、大豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶的活化酶2(GmRCA2)、大肠杆菌高丝氨酸O-转琥珀酰酶(EcMetA)]进行基因融合并使其在大肠杆菌中诱导表达,发现ACP融合能显著增强这些重组靶蛋白的可溶性。另外,对重组蛋白的热处理和酶活性分析发现,融合ACP还能极大提高这三个靶蛋白的热稳定性,并有效保护JcAPX1酶活免遭热失活,使其耐热性提高了至少2℃。ACP的这种效果推测可能与其高酸度特性有关,可以作为一个新的功能酸性融合标签。     

三角褐指藻丙二酰单酰辅酶 A:酰基载体蛋白转酰基酶的功能分析

【背景】丙二酰单酰辅酶A:酰基载体蛋白转酰基酶(malonyl coenzyme A:acyl carrier protein transacylase, MCAT)是Ⅱ型脂肪酸合酶(fatty acid synthase Ⅱ, FASⅡ)的重要亚基,与脂肪酸合成直接相关,然而关于微藻MCAT的信息却很少。【目的】验证三角褐指藻MCAT的功能。【方法】在模式硅藻三角褐指藻的全基因组序列中发现了一个可能的mcat基因序列,对其进行生物信息学分析,构建原核表达载体,并转入MCAT缺陷型大肠杆菌L48菌株中,最后利用GC-MS分析突变株脂肪酸的成分和含量。【结果】三角褐指藻MCAT主要结构为α-螺旋和无规则卷曲,与圆柱脆杆藻的亲缘关系最为接近,为protits型MCAT;三角褐指藻MCAT的表达使MCAT缺陷型大肠杆菌L48菌株恢复了合成脂肪酸的功能;对L48回复突变株的脂肪酸组成进行分析,发现该酶对C14:0具有底物偏好性,从而促进中长链脂肪酸如C16:0和C17:1的合成,这一特点与protits型MCAT的特性基本相符。【结论】三角褐指藻MCAT能促进脂肪酸的合成,这为微藻脂肪酸合成及...     

肠出血性大肠杆菌毒力因子Z1444的原核表达及其丝/苏氨酸激酶活性验证

目的:在大肠杆菌中表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)毒力岛上的毒力因子Z1444并纯化,对其丝/苏氨酸激酶活性进行初步检测。方法:根据GenBank中Z1444基因序列及pET-28a(+)载体的多克隆位点设计引物,以EHECO157∶H7全菌裂解液为模板,经PCR钓取1047 bp的目的片段,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a(+)-Z1444,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导蛋白表达并经SDS-PAGE鉴定,利用体外反应体系鉴定重组蛋白的丝/苏氨酸激酶活性。结果:双酶切和测序鉴定表明,pET-28a(+)-Z1444原核表达质粒构建正确;诱导表达后经纯化,获得纯度在90%以上的可溶性重组Z1444,相对分子量约为38×103;体外酶活实验验证了Z1444的丝/苏氨酸激酶活性。结论:Z1444在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,为后续功能验证奠定了基础。     

细菌双杂交筛选大豆GmWNK1互作蛋白系统的建立及应用

本研究利用大肠杆菌双杂交系统构建了一个高质量的大豆根系cDNA文库,同时利用大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建了融合表达质粒pBT．GmWNK1,经酶切和测序鉴定、诱饵融合蛋白的表达检测及诱饵融合蛋白的自激活鉴定后作为诱饵,从大豆根部cDNA文库中筛选与GmWNK1发生互作的蛋白质,共获得18个阳性克隆。经测序和同源性比对发现,有10个阳性克隆编码已知蛋白,8个为假阳性。研究结果为揭示WNK基因家族的生物学功能和调控机制提供了重要的参考数据和研究材料。