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人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
人尿激酶原是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性,为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达pro-UK,我们在pAc373基础上,插入野生型AcMNPV polyhedrin启动子区-7~-1碱基序列,构建了一个高表达转移载体pAcYT.分别经三次克隆将pro-UK cDNA正向插入到转移载体pAc373或pAcYT的BamHI-KpnI位点上。用Lipofectin将pAcYT-UKDN 相似文献
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在转瓶和2L搅拌反应器中,利用重组杆状病毒AcNPV感染sf9昆虫细胞表达尿激酶原。在转瓶中,细胞接毒密度12×106/mL、MOI=30时,尿激酶原活性达到1065IU/mL。研究了尿激酶原表达过程中葡萄糖、乳酸的代谢变化。实验结果表明细胞状态对尿激酶原的表达水平有显著影响。 相似文献
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昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达尿激酶原* 总被引:2,自引:0,他引:2
在转瓶和2L搅拌反应器中,利用重组杆状病毒AcNPV感染sf9昆虫细胞表达尿激酶原。在转瓶中,细胞接毒密度1.2×106/mL、MOI=30时,尿激酶原活性达到1065IU/mL研究了尿激酶原表达过程中葡萄糖、乳酸的代谢变化。实验结果表明细胞状态对尿激酶原的表达水平有显著影响。 相似文献
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昆虫细胞的大规模培养 总被引:3,自引:0,他引:3
昆虫细胞的大规模培养李文青,肖成祖(北京军事医学科学院生物工程研究所,)昆虫细胞培养的鼻祖是德国人forhardBendict(1878—1958)[1],他在1915年发表了有关昆虫细胞培养的第一篇文章[2]。早期,昆虫细胞的培养是为了进行昆虫的生... 相似文献
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斜纹夜蛾细胞系(SL-1)和家蚕细胞系(BmN)均能在国产微载体上正常生长增殖。以3mg/ml微载体培养细胞,两种昆虫细胞生长最高密度分别为8.2×10~5细胞/ml和7.6×10~5细胞/ml。扫描电镜观察显示一个微载体可贴附几十个,有的多达上百个细胞。两性昆虫细胞的微载体培养特征与常规静止培养无甚差异。 相似文献
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人尿激酶原(pro-urokinase,pro-UK)是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性。为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达pro-UK,我们在pAc373基础上,插入野生型AcMNPV polyhedrin启动子区-7~1碱基序列,构建了一个高表达转移载体pAcYT。分别经三次克隆将pro-UK cDNA正向插入到转移载体pAc373或PAcYT的BarnHI-KpnI位点上。用LiPofectin将pAcyT-UKDNA或pAc373-UK DNA与AcMNPV DNA共转染到昆虫Sf9细胞中,空斑法筛出重组病毒阳性克隆株。高效表达结果是:1.ELISA法确定重组病毒Sf9细胞分泌表达产物pro-UK为96mg/L培养基上清,平板法测定溶圈活性为1600IU/mL培养基上清;2.亲和层析一步法纯化表达产物,回收率选70%,以上,比活约为60000IU/mg;3.纯化的pro-UK,无论是否经还原处理,其SDS-PAGE图谱均为相同的单一条带,MR 50000;4.Western blot与SDS-PAGE图谱吻合。 相似文献
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RGDS-尿激酶原嵌合体的构建与表达 总被引:6,自引:0,他引:6
利用定点突变及DNA重组技术,构建了在尿激酶原K区C端的β发夹区插入了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸〔RGDS〕片段的尿激酶原嵌合体基因,并利用昆虫杆状病毒表达系统通过感染Sf9细胞对野生型及嵌合体尿激酶原进行了高效表达,表达量分别为1200~1800IU/(106细胞·ml)和1800~2400IU/(106细胞·ml).经过CM-SepharoseFF离子交换层析、SephadexG-75凝胶过滤层析及超滤浓缩对野生型及突变型进行了部分纯化,并对其性质进行了初步研究.表明突变体尿激酶原保留了全部尿激酶原的纤溶酶原激活活性,并具有很强的抗血小板聚集活性.RGDS-尿激酶原嵌合体兼有溶栓及抗栓活性 相似文献
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用鸡β- globin的MAR序列和人看家基因延伸因子1α(hEF-1α)的调控序列以及旱獭RNA稳定与输出序列,构建了重组人尿激酶原(recombinant human pro-urokinase,rhPro - UK)的高效表达载体,在CHO细胞中获得了rhPro - UK的高效稳定表达,rhPro - UK的表达水平达到1299 IU(以百万细胞1d的表达量计).采用阳离子交换层析、疏水层析和凝胶排阻层析的三步工艺纯化表达rhPro - UK的CHO细胞培养上清液,rhPro - UK的纯度达到98%、回收率为60% ~70%. 相似文献
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目的:建立基于Tet-on系统的可调控真核细胞表达小鼠尿激酶原激活剂(uPA)的诱导表达系统。方法:提取C57小鼠肾组织总RNA,RT-PCR扩增uPAcDNA序列;提取基因组DNA,扩增uPA编码区后最后一个外显子序列,构建pTRE2-uPAcDNA-700载体,将其与pTet-on瞬时共转染Huh7细胞系,24h后用强力霉素诱导表达,诱导后36h分别收集细胞和培养上清(诱导组),提取细胞总RNA并进行细胞uPA转录水平的检测;采用溶圈法对细胞分泌至培养上清中uPA的生物活性进行检测,同时以转染但未诱导Hun7(未诱导组)和正常培养Huh7(正常对照组)细胞及培养上清作为对照。结果:与未诱导组和正常对照组相比较,仅诱导组在转录水平上扩增出目的条带;溶圈法证实转染的细胞不仅表达uPA,而且表达的蛋白具有一定的生物活性。结论:构建了可调控的uPA真核诱导表达系统,为进一步制备可调控肝细胞表达uPA转基因小鼠及进一步揭示uPA肝损伤机理奠定了基础。 相似文献
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不同哺乳动物细胞表达尿激酶原的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
以重组尿激酶原(pro-UK)为研究对象,构建了细胞表达载体,对不同细胞表达载体进行了较为系统的比较性研究。确定了所构建pro-UK三种载体的表达特性,成功建立了pro-UK哺乳动物细胞表达系统。重组Namalwa、Vero和Sp2/0细胞表达proUK的水平分别是200、12.5和50IU/(10.6 cell.24h)。亲和层析纯化pro-UK纯度在90%以上。免疫吸附溶酰胺测定表明CHO细胞表达pro-UK单链比例最低,而Vero和Namalwa细胞表达pro-UK单链比例最高。该研究对生产pro-UK时,选择更好的哺乳动物细胞表达系统具有重要的指导意义。 相似文献
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应用RT-PCR技术,从人黑色素瘤Bowes细胞株中扩增出人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)cDNA。序列分析证实,与国外的报道完全一致。将含完整阅读框架的人t-PAcDNA克隆至昆虫细胞表达转移载体pBacPAK8中,获得重组质粒pBac-tPA。应用脂质体共转染法,将pBactPA和线性化杆状病毒BacPAK6DNA共转染Tn-5B-1昆虫细胞。经空斑筛选获得11株重组病毒。经PCR鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达t-PA的重组病毒BactPA3。在含胎牛血清的培养基中,t-PA表达活性在感染(MOI≈10)后72h左右达到最高,为3.04×103IU/ml,即相当于1.8×104IU/106细胞;在无血清培养基中,t-PA最高表达水平相差不大,但时间为感染后132h左右。经SDS-PAGE纤维蛋白自显影分析,分子量为68kda左右。与从人黑色素瘤细胞培养液中提纯的天然t-PA相比,其受纤维蛋白原激活的特性、和纤维蛋白的亲和力及在血浆中的失活速率基本相同。表达的t-PA在血液循环中的半衰期为7min。 相似文献
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昆虫细胞培养已经在小儿灰髓炎、乙肝表面抗原等研究中得到系统应用,此外,许多高值的治疗性蛋白药物,如tPA、白细胞介素-2、β-干扰素和促红细胞生成素等的研究过程中昆虫细胞及杆状病毒的培养已成为新的生物工程手段。在美国、荷兰等国已成功地得到了外源基因大量表达的药物。在我国也已成功构建了人-α干扰素的昆虫细胞/杆状病毒表达系统。同时昆虫杆状病毒本身可以制备成各种专一性较强的广谱、无公害、无毒性的的农用杀虫剂。但是昆虫细胞及其杆状病毒的大规模培养对 相似文献
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我国昆虫分子生物学研究的回顾和展望 总被引:17,自引:0,他引:17
1953年,Watson和Crick发现了DNA双螺旋结构,奠定了现代分子生物学的基础,从而给生命科学研究带来了一场革命。以研究基因结构和功能为主的分子生物学和以DNA重组技术为核心的生物技术研究,在本世纪取得了飞跃发展,预示了分子生物学和生物技术将成为21世纪的发展方向,是具有远大发展前景的新兴学科和产业。昆虫生理生化研究对生物学基础研究和分子生物学的发展作出过重要贡献,例如基因一酶的学说、类固醇激素作用机理和细胞摄取生物大分子的细胞内吞作用都是首先在昆虫中发现。另外,果蝇的研究也为分子遗传学和分子生物学的发展… 相似文献
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采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150~156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450~500IU/106cell/24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa.绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。 相似文献
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