哺乳动物克隆及其应用前景

细胞核移植一词最早出现于Ｓｐｅｍａｎｎ(1938)所著《胚胎发育与诱导》一书中,他建议把发育后期的细胞核移植到去核的卵中,以研究细胞核的发育能力,但由于当时实验条件的限制而未能够实施。直到1952年,Ｂｒｉｇｇｓ和Ｋｉｎｇ才第一次报道了蛙的胚胎细胞核移植成功。Ｇｕｒｄｏｎ(1962)将爪蟾蝌蚪期肠上皮细胞核移植到去核的卵母细胞中,重构胚胎发育成正常的个体;而将成体爪蟾的肠上皮细胞核移入去核卵母细胞中时....     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h、52 h和56 h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚.研究结果表明,成熟44 h的卵母细胞核移植后有较高的融合率(58.99%)、卵裂率(67.52%)和囊胚率(22.78%),而成熟48 h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44 h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40 h、36 h、32 h、28 h的卵母细胞的分裂率与囊胚率(P＜0.05).卵龄为48 h的卵母细胞融合率高于卵龄为52 h卵母细胞的融合率(P＜0.05).同时我们还探讨了不同去核方法(盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system)对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响.研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%.Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率(P＞0.05),而与Spindle-view法去核率没有差异(P＞0.05).三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著(P＞0.05),但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著(P＜0.05).进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著(P＜0.05);两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考.     

哺乳动物卵母细胞生发泡移植

生发泡(GV)移植是指将GV期卵母细胞的GV移入到去核的受体细胞(GV期卵母细胞、MII期卵母细胞或受精卵)透明带下,经融合形成一个重组卵的过程。GV移植对研究卵母细胞的细胞周期调控、成熟及受精时细胞核与细胞质之间的相互作用非常重要,可用于研究卵母细胞减数分裂异常和与年龄相关变化之间的关系及细胞质衰老与卵母细胞非整倍性之间的关系。现简要介绍了GV移植的基本程序,GV核体与胞质体的融合,重组卵的培养条件,重组卵成熟后的受精、人工激活和胚胎发育能力以及GV移植的意义。     

化学辅助去核法对绵羊卵母细胞去核率和重构胚发育率的影响

为提高绵羊体细胞核移植的效率,本研究采用一种新的去核方法—化学辅助去核法,对绵羊体外成熟的卵母细胞进行去核,研究了化学诱导剂秋水仙素的处理浓度、作用时间、卵母细胞的成熟时间对去核效果及重构胚发育的影响。结果表明:1)卵母细胞在0.4μg/mL的秋水仙素溶液中分别孵育0.5h和1h,胞质突起率和去核率没有显著的差异,突起率可高达85.4%,去核率达到100%;2)0.2μg/mL或0.4μg/mL秋水仙素溶液将卵母细胞处理0.5h,对去核效果没有显著影响;3)对于体外成熟18～23h的卵母细胞,随着成熟时间的延长,盲吸法的去核率降低,但没有影响秋水仙素诱导胞质突起的比率和去核率;4)两种去核方法对重构胚的发育没有产生显著影响,但成熟21～23h卵母细胞重构胚囊胚的发育率显著高于成熟18～20h卵母细胞重构胚囊胚的发育率。综上所述,本试验优化了绵羊卵母细胞化学辅助的去核程序,利用化学辅助去核法对高卵龄的绵羊卵母细胞进行去核,提高了去核率和重构胚的体外发育率。     

泥鳅雄核发育纯合二倍体的产生

以机械方法挑去泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)×大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)(♀)属间杂交受精卵的雌核,得到泥鳅雄核发育单倍体胚胎。将这种单倍体胚胎的囊胚细胞核移植到大鳞副泥鳅去核卵中,获得了243个原肠胚胎,其染色体鉴定表明,29.6%的核移植体的染色体发生了加倍。在另一实验组中,从769个核移植卵得到了5尾2cm以上的个体。尾鳍染色体鉴定、肌肉LDH同工酶电泳和形态鉴别表明,这5尾核移植体为泥鳅雄核发育纯合二倍体。     

牛体细胞核移植显微操作环节的优化

本研究从牛卵母细胞去核方法(纺锤体观测仪法&Hoechst33342染色法)、供体细胞核引入去核卵细胞质的方法(卵细胞质注射法和电融合法)和重构胚胎电融合(3组参数)等3个环节对牛体细胞核移植的显微操作过程及相关参数进行了筛选优化。以核移植胚胎的卵裂率、囊胚发育率作为检测指标,对不同的方法所获得的克隆胚胎的卵分裂率与囊胚发育率进行比较,最后筛选获得1个优化的牛体细胞核移植操作程序,即采用Spindle view系统对牛卵母细胞进行去核操作,将供核体细胞注射到卵周隙,然后通过电融合法将供体核引入去核卵细胞质(电融合参数为1.9kV/cm,脉冲时程10μs,方波2次间隔2s)。以此核移植程序进行牛体细胞核移植实验,自获得克隆胚胎中筛选80枚优质囊胚移植到33头受体牛子宫内,最后2头母牛产下2头克隆牛犊,结果表明利用该优化的显微操作环节进行牛体细胞核移植可以获得体细胞克隆牛犊。     

鼠猪异种细胞核移植

核质关系是细胞生物学和发育生物学研究的核心问题之一。细胞核移植技术是研究发育中核质关系的重要手段。尽管最近哺乳动物的细胞核移植取得了重大突破 (Ｗｉｌｍｕｔ等 ,1997;Ｗａｋａｙａｍａ等 ,1998) ,但这些成功实验是在种内进行的 ,而异种间核移植的研究报道较少 (ＭｃＧｒａｔｈ等 ,1986 ;Ｗｏｌｆｅ等 ,1992 ;梅祺等 ,1993)。最近 ,陈大元等( 1999)报道将大熊猫的子宫上皮细胞、骨骼肌细胞和乳腺上皮细胞的细胞核移入去核的兔卵母细胞后 ,分别有9 9%、6 8%和 11 7%的重构卵发育到囊胚。Ｄｏｍｉｎｋｏ等( 1999)把绵羊、猪、猴或大…     

鼠兔核质杂交胚胎早期发育的研究

细胞核移植技术已被证明是研究发育中核质相互关系的非常重要的手段之一,电融合技术也是近十年发展起来的新型细胞融合技术。本实验运用这两项技术,进行了鼠、兔目间核质杂交实验,小鼠8-细胞核在激活的兔去核卵母细胞中,发生了染色体超前凝聚及核膨胀,融合卵移植到小鼠输卵管4.5天后,冲洗出,有5.4%的重构卵发育到囊胚期,通过染色体检查,囊胚细胞中均为小鼠染色体,其中一个囊胚为正常小鼠核型(2 n=40,XX)。通过本实验,我们认为:鼠兔远缘核质杂交胚胎的早期发育是可能的。     

硬骨鱼类体细胞核移植的研究

本文用不同属、科、目的硬骨鱼类作材料进行体细胞核移植研究。鲫鱼（Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓ）、鲮鱼（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ）和尼罗罗非鲫（Ｔｉｌａｐｉａｎｉｌｏｔｉｃａ）的体细胞核（头肾细胞）移植到鲤鱼（Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）的成熟去核卵中,通过继代核移植,在鲫鱼体细胞核和鲤鱼去核卵的属间组合中,获得发育到血液循环期的幼鱼;在鲮鱼体细胞核和鲤鱼去核卵的亚科间组合中,获得发育到心脏跳动期的晚期胚胎;在尼罗非鲫体细胞核和鲤鱼去枚卵的目间组合中,获得发育到肌肉效应期的胚胎。由于是直接用成鱼体细胞核作供核体进行核移植,因而能够克服供体鱼和受体鱼不同步产卵的困难。实验结果表明,这对进行硬骨鱼类核质杂交研究无疑是一种简便而又有效的方法。     

核移植技术研究进展

核移植(nuelear transplation,NT)是将动物早期胚胎或体细胞的细胞核移植到去核的受精卵或成熟卵母细胞中、重新构建新的胚胎,使重构胚发育为与供核细胞基因型相同后代的技术过程,又称动物克隆技术。广义的胚胎克隆技术还包括胚胎分割和卵裂球培养,通常所指的胚胎克隆技术是指狭义概念,即核移植技术。1938年Spmann在所有胚胎细胞都具有与受精卵完全相同、拥有潜在发育全能性的细胞核基础上提出了细胞核移植的概念[‘1。早期核移植实验是在变形虫、蛙、爪蟾、非洲爪蛙等两栖类和鱼类上进行的核质关系研究〔“一“〕,随着胚胎技术的不断进步…     

鼠兔核质杂交胚胎早期发育的研究

细胞核移植技术已被证明是研究发育中核质相互关系的非常重要的手段之一,电融合技术也是近十年发展起来的新型细胞融合技术也是近十年发展起来的新型细胞融合技术,本实验运用这两项技术,进行了鼠、兔目间核质杂交实验,小鼠８－细胞核在激活的兔去核卵母细胞中,发五了染色体超前凝聚及核膨胀,融合卵移植到小鼠输卵管４．５天后,冲洗出,有５．４％的重构卵发育到囊胚期,通过染色体检查,囊胚细胞中均为小鼠染色体,其中一个囊     

电脉冲介导金鱼囊胚细胞融合及其发育能力的研究

本实验首次成功地利用电脉冲介异法使金鱼的囊胚细胞融合,融合率高于95％,并通过细胞核移植方法,将融合细胞的细胞核移入金鱼成熟未受精的去核卵内,以了解融合后细胞核的发育能力。实验中共移植111个细胞核,得44个囊胚、7个原肠胚和1条活了8天的幼鱼(因不进食而死亡)。并对移核后发育至囊胚的胚胎用静态光度计测定了DNA含量,共测定了11个移核胚胎的细胞,其中9个移核囊胚细胞核的DNA含量增加,这一结果证明:利用电脉冲介导法能有效地转移外源染色体,供体核有促进个体发育的能力。为人工干与鱼类染色体组的组成,进一步研究鱼类个体发育对染色体倍性的依赖关系以及体细胞遗传提供了一条新途径。     

母源物质对重编程作用研究进展

卵母细胞发生过程中会积累大量的物质,即所谓的母源物质(maternal materials),自然状态下,这些母源物质对受精以及之后的发育具有重要的生物学功能。雌雄配子融合后,精子核与卵母细胞中单倍体染色体组均会发生剧烈的表观遗传修饰变化,这个过程也同样发生在体细胞核移植到卵母细胞质之后,这种变化被称之为重编程。重编程奠定了新个体发生发育全部程序的基础,因此是一个备受重视的生物学过程。重编程包括DNA去甲基化、染色质重塑和组蛋白修饰等。受精后,卵母细胞与精子的基因组均会在一定时间和空间范围内经历相应的重编程过程,清除各自基因组在配子形成中保留的表观遗传学修饰,调控基因表达并形成正常发育的全能性胚胎。受精后,卵母细胞成熟中积累的多种母源物质聚集在雄原核周围,调控其基因组的重编程。体细胞核移植胚胎中供体细胞核注到去核卵母细胞后也将在卵母细胞中蛋白质、mRNA、酶类等母源物质的作用下进行重编程。现总结了母源物质对雄原核及供体细胞核重编程作用的研究进展,并探讨了母源物质作用的可能机制。     

金鱼胚胎细胞超低温保存及其发育能力的研究

将金鱼囊胚期的细胞分离后,保存于-196℃液氮中,并对保存后化冻的细胞用细胞核移植的方法检测了其细胞核发育的能力。本文首次证明了经冷冻后的细胞核被移至去核卵中能发育成正常的个体。并证明在冷冻液中加入胶原蛋白可以提高化冻后细胞的存活率。本实验的结果为长期保存端黄卵的各种鱼类的基因库提供了新的途径。     

Demecolcine化学辅助去核技术在牛体细胞核移植中的初步研究

本实验目的是研究demecolcine辅助去核的卵母细胞能否支持牛的核移植胚胎的发育。通过化学药物demecolcine处理牛MII期卵母细胞来辅助去除牛卵母细胞核,并用去核的卵母细胞做受体,进行核移植的研究。实验结果显示,demecolcine辅助去核后的卵母细胞质膜有明显一个或二个突起,并且突起内都含有卵母细胞染色体组,显示去核效果较好（57.89%～73.3%）。药物处理一小时为最适时间,去核率可达73.3%。对demecolcine辅助去核的卵母细胞的核移植胚胎发育情况显示囊胚率较盲吸法核移植胚胎较好（12.5%VS10.2%）,但二者差异不显著(p>0.05)。Demecolcine药物处理后的卵母细胞能够支持核移植胚胎的发育。Demecolcine辅助去核可以在牛体细胞核移植中的到应用。     

鱼类染色体转移—仙台病毒融合胚胎细胞核移植的初步研究

细胞杂交技术近二十年来取得了巨大的成 就,现已被广泛地应用于医学和生物学各个领 域[4,51。但是体细胞杂交只能得到杂交的细胞, 还不能得到杂交的个体,至少在动物界是如此。 在植物方面已经能通过原生质体的融合产生杂 交细胞,再通过杂交细胞的培养产生新的再生 植株〔2,71。而动物的繁殖只能由生殖细胞通过 胚胎发育才能产生新的个体。虽然不少人曾做 了许多尝试,想通过卵子和体细胞人工融合的 方法产生杂种,但迄今还没有成功［[8-10,1310童第 周等11,11,121在鱼类细胞核移植方面做了不少工 作,利用鱼类囊胚细胞的核,移植到不同属和不 同亚科的去核未受精成熟卵内,得到了几种核 质杂种鱼。这些工作不但证明了鱼类早期囊胚 细胞具有发育的全能性,同时也说明利用动物 早期胚胎的体细胞核育种的可能性。那么用囊 胚细胞的融合引进外来的染色体以及改造原有 细胞的遗传组分,然后把融合的囊胚细胞的核 移植到去核的未受精的成熟卵里去,是不是能 产生具有新的遗传性状的个体呢？本实验正是 基于这样的目的进行的。首先我们使用同源的 囊胚细胞融合,然后移植核,以了解：(1)鱼类 囊胚细胞融合的条件;(2)融合后的囊胚细胞核 移植是否能促使卵子发育;(3）发育的胚胎染色 体组成如何？以便为导人异源染色体创造条件。     

卵母细胞的生发泡移植

生发泡(germinal vesicle,GV)移植到去核的GV期卵母细胞后,获得重构卵,重构卵在体外能成熟,受精和进行胚胎发育。GV移植到去核的第二次减数分裂中期(metaphase Ⅱ,MII)卵母细胞后,重构卵能发生GV破裂,但难以排出第一极体。GV移植后,通过连续核移植,重构合子具有发育到终期的能力。GV移植为研究卵母细胞的发育提供了一种重要工具。     

鱼类囊胚细胞和卵的电融合

细胞核移植是研究细胞分化、核质关系等有效手段,已取得了较好的成绩。但由于细胞核移植是一种显微操作技术,技术难度较大,尚难以普及与推广。我们在进行鱼类细胞电融合初步成功的基础上,开展了鱼类囊胚细胞和未受精卵的电融合研究,探讨电脉冲可逆击穿能否将外源细胞核引入卵内?以及外源细胞核能否促进未受精卵分裂、发育成正常的个体?       

用改进的细胞核移植方法构建重构胚

为了能够找出一种既容易操作,又不需要特殊设备的核移植方法,对以前的操作进行了改进。首先以预先吸有细胞核或细胞的注射针在固定于持卵针上的卵母细胞透明带上穿刺两个孔,然后一边缓慢地将注射针回拔至卵周隙中,一边逐渐增加持卵针中的负压,直至极体与目标核质被完整吸入持卵针中而完成去核,最后在不拔出注射针的情况下直接注射细胞核或完整细胞进而完成重构胚的构建。用此方法对200个卵母细胞进行注核和注细胞操作,平均完成一个重构胚的构建各自耗时约40s和30s,成功率分别为62.6%和86.0%。用核染料Hoechst 33342 对卵母细胞的去核效率进行验证,去核成功率达到73.3%。实验证明,用此方法可以在只有倒置显微镜和显微操作仪的条件下一次性快速完成去核和注核,大大提高了细胞核移植的效率和重构胚成活率;更重要的是该方法操作简单,新手可以很快掌握该技术,易于在实际工作中推广应用。     

两种散白蚁两性生殖与孤雌生殖胚胎发育比较研究

【目的】探究散白蚁两性生殖胚胎和兼性孤雌生殖胚胎各自的发育特点。【方法】以黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis和尖唇散白蚁R.aculabialis各自的受精卵(雌雄配对所产的卵)和未受精卵(雌雌配对所产的卵)为研究对象,采用激光共聚焦显微镜观测两种散白蚁的受精卵和未受精卵的卵裂状态,数码显微系统拍照观察卵的外部形态变化。【结果】黑胸散白蚁蚁后所产的受精卵和未受精卵在巢中均能进行卵裂,但是未受精卵在24和48 h时的卵核数无显著性差异,而受精卵卵核数在24和48 h时有显著性差异;15 d时未受精卵的体积没有发生显著变化,而受精卵的体积显著性增大;15-20 d时未受精的蚁卵死亡,而受精卵正常发育。尖唇散白蚁受精卵和未受精卵在相同的时间段内卵核数没有显著性差异,48 h时的卵核数明显比24 h时多;第10天时受精卵长度和宽度发生显著性变化,同时体积也明显增大,而未受精卵在第15天时长度和宽度才开始发生显著性变化,同时体积也开始显著增大。【结论】具有兼性孤雌生殖能力的尖唇散白蚁,受精卵和未受精卵卵裂速度相同,但受精卵外形体积变化比未受精卵早。黑胸散白蚁未受精卵能继续进行卵裂,但发育异常,不能孵化;两种白蚁卵发育过程中卵的长度和宽度同时发生变化。黑胸散白蚁孤雌卵的卵裂特性可能是白蚁两性生殖向兼性孤雌生殖进化的过渡适应阶段。