空肠弯曲菌FlaA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】原核表达空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA,并制备其单克隆抗体。【方法】克隆目的基因并将其构建到pET30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,分别以变复性纯化后的rHis-FlaA、rGST-FlaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和单抗腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析单抗特异性。【结果】成功构建pET30a(+)-flaA和pGEX-6p-1-flaA重组原核表达质粒,并融合表达rHis-FlaA和rGST-FlaA蛋白,Western blot试验显示天然蛋白多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应,表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗FlaA的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为2D12、5E12、6A9,其Ig亚类分别为IgG2a、IgG1、IgG1,腹水效价分别为1∶102400,1∶102400和1∶51200;Western blot试验显示,3株单抗均能与表达rHis-FlaA重组蛋白的细菌发生特异性反应;Dot-ELISA试验表明,3株单抗均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。【结论】本研究制备的单克隆抗体有较高特异性,具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌鞭毛蛋白的生物学特性、致病机理,以及建立快速检测技术奠定基础。     

儿童的幽门弯曲菌感染

Hill及其同事报告了在25名儿童中有6名从胃内分离出了幽门弯曲菌。这些儿童中有4名患有慢性胃炎,19名幽门弯曲菌阴性儿童和另外2名阳性病例无胃炎的迹象。     

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备

[目的]小麦赤霉病菌产生的毒素不仅在病害发展过程中具有加重赤霉病的作用,而且污染谷物导致严重的食用安全性问题.由于赤霉病的普遍发生,有必要建立快速、灵敏、有效的毒素检测方法,本试验旨在制备可用于检测被脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的粮谷类特异性单克隆抗体.[方法]本实验首先将脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的衍生物3-半琥珀酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-HS-DON-OVA)与卵清蛋白(OVA)采用碳化二亚胺法进行偶联得到人工抗原,以此人工抗原免疫BALB/C小鼠,取该鼠脾细胞与SP2/O鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和克隆,得到了1株能稳定分泌DON抗体的单克隆细胞株(382),并制备单克隆抗体腹水.[结果]经检测382的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链.腹水通过间接酶联免疫吸附测定效价在1×10-7以上.该单克隆抗体与脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异性结合反应的50%抑制质量浓度为29 μg/L,除与3-acetyldeoxynivalenol(3-Ac-DON)的交叉反应率为78.38%,与其他脱氧雪腐镰刀菌烯醇结构类似物无交叉反应.[结论]本实验所制备的单克隆抗体有较高的灵敏度和特异性,具有较好的应用价值.     

迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体的制备及鉴定

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是肠杆菌科爱德华菌属的一种条件致病菌,可引起败血病,危害鲆、鲤等经济养殖鱼类。但是,经过20余年的研究,虽有各种灭活疫苗和组分疫苗的试验,却无针对该菌病的商品化疫苗的使用报道。抗独特型抗体疫苗技术已成功用于肿瘤、细菌、病毒、寄生虫的防治,具有安全、易大规模生产等优点。鉴于药物防治鱼菌病的局限性,作者在制备了抗迟缓爱德华菌单克隆抗体的基础上,制备抗该菌的抗独特型单克隆抗体,用该菌抗独特型抗体免疫牙鲆, 为预防该菌病提供一种安全有效的新方法。       

幽门弯曲菌的中草药敏感试验

自从Warren和Marrshall报道幽门弯曲菌(Campylobacter Pyloridis 以下简称CP)感染与胃炎和消化性溃疡密切相关以来,国内外相继有类似报道,但中草药对该菌抗菌作用的研究尚未见报道,本文通过预试选择20种中草药和两种方剂对50株幽门弯曲菌进行抑菌和杀菌试验,现报告如下。 1.材料与方法 1.1 药物来源及药液制备中草药购自当地医药公司。将被测单味药或复方药分别置于1000ml烧杯中.加10倍蒸馏水浸泡3小时,以文火煎煮30分钟,过滤于烧杯中。剩余药渣再加适量蒸馏水进行第二次煎煮,过滤。两次药液合并后以蒸馏水补足或以文火浓缩至药液体积与药物原重量相等,其浓度即为100％(W/V),灭菌备用。     

幽门弯曲菌游离氨基酸的测定

本实验采用DNS-Cl(Dimethylamino Naphthalene-5-Sulfonyl Chloride丹酰氯)荧光试验标记氨基酸,用聚酰胺(Polyamide)薄膜层析方法检测幽门弯曲菌游离氨基酸。结果CP-M717菌株测有15种氨基酸;CP-M813株测有18种氨基酸。按构成比分析CP-M717与CP-M813株主要氨基酸所占比例基本一致。     

抗hAFP单克隆抗体的制备

人甲种胎儿蛋白(hAFP)是一种重要的分化抗原和肿瘤相关抗原,是癌肿早期诊断和胎儿产前诊断中的一个重要标志物。本文应用 B 淋巴细胞杂交瘤技术,将为 hAFP免疫的 BALB/C 小鼠脾细胞与 SP2/O 骨髓瘤细胞通过化学方式融合,从而筛选出稳定分泌抗 hAFP 单克隆抗体的二株杂交瘤细胞株。     

空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】原核表达空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素B蛋白(CdtB),制备其单克隆抗体(mAb),并研究mAb抗毒性作用。【方法】扩增空肠弯曲菌cdtB基因并将其构建到pET-30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,以原核表达的GST-CdtB蛋白为免疫原,应用杂交瘤技术进行细胞融合;采用间接ELISA方法测定细胞上清和mAb腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析mAb特异性,并以CaCo-2和HD-11细胞为模型,鉴定mAb抗毒性能力。【结果】成功构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-cdtB和pGEX-6p-1-cdtB,并融合表达rHis-CdtB和rGST-CdtB蛋白。获得5株稳定分泌CdtB抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F3,1F5,2E4,2E11,2F2。抗体Ig类和亚类检测显示2E11 Ig亚类为IgG2b,其他4株均为IgG1。抗体效价高达1:(1×108)。Dot-ELISA试验表明5株mAb均能与空肠弯曲菌标准株发生特异性反应,与非空肠弯曲菌呈阴性反应;Western blot法分析表明5株mAb均能与纯化蛋白rGST-CdtB有良好的反应性。基于CaCo-2细胞的黏附和侵袭实验表明mAb能显著降低细菌的黏附和侵袭能力(P0.01)。【结论】成功制备了针对空肠弯曲菌CdtB蛋白的mAb。为进一步研究空肠弯曲菌致病机制,以及为研制治疗性类药物奠定了基础。     

幽门弯曲菌的生物学特性的研究

我们对各型胃病患者共300例进行了幽门弯曲菌(Campylobacter pylori 以下简称CP)检查。以10%小牛血清布鲁氏菌肉汤为保存液,6%羊血布鲁氏菌琼脂平皿作培养基,在微氧条件下分离 CP,阳性率为65%。用改良尿素酶快速诊断的(4小时敏感性)阳性率为34.6%,及95.4%(24小时),特异性为100%。胃粘膜研磨液直接涂片,用0.3%碱性复红染色后镜检,二者阳性符合率为87.2%。CP 的生化试验表明,氧化酶、过氧化氢酶、尿素酶呈阳性反应;葡萄糖发酵、硝酸盐还原及3.5%NaCl 均为阴性。药敏试验的结果显示 CP 对庆大霉素、四环素、红霉素、氯霉素、羧苄青霉素,痢特灵、卡那霉素、先锋霉素等敏感;而对磺胺、萘啶酮酸、多粘菌素 B 等耐药。CP 经口感染小鼠 C57、及 BALb/c,与金黄色地鼠,均无致病性表现。     

幽门弯曲菌MLE无血培养基的研究

用MLE无血培养基与MHC(M-H血巧克力琼脂)培养基同时进行已知幽门弯曲菌(Cp)的培养及胃粘膜活检标本中Cp的分离试验。结果表明,16株已知菌在MLE培养基上生长的菌落比MHC上丰茂,特点明显,两者的菌体形态及生化反应一致。200份胃粘膜活检标本用MLE培养基分离阳性者114例,阳性率为57.0％,用MHC分离阳性者101例,阳性率为50.5％,符合率为86.5％,分离阳性率MLE高于MHC(p<0.05)。我们认为MLE无血培养基可代替含血培养基用于培养分离Cp。     

幽门弯曲菌的微生态学研究现状

近年来,关于幽门弯曲菌和慢性胃炎关系的研究报道层出不穷,但该课题进展不快,其主要限制因素是没有成功的动物模型。目前开展幽门弯曲菌的微生态学研究对该课题停滞不前的状态无疑有推劫作用。但至今这方面资料尚很少见。本文旨在初步探讨决定幽门弯曲菌胃粘液定植和生存的几个微生态学因素,以便引起有关研究者的重视。     

幽门弯曲菌感染的快速诊断研究进展

<正>近年来各国学者对一类与胃炎、胃及十二指肠溃疡等疾病相关的微生物-幽门弯曲菌(Campylobacter pyloriclis,简称(P)研究报告日趋增多,并已引起全世界医学界的广泛兴趣和高度重视。自从1983年澳大利亚Marshall首次从胃窦活检标本中分离培养cp获得成功。随后Marshal等用自身试验和Girdwood等通过比较正常人及胃炎、胃、十二指肠溃疡的病人CP分离阳性率与疾病转归的关系以及对治疗效果的观察等,提出了CP胃炎的观点,并认为CP是引起CP胃炎及胃肠溃疡的病原菌。病人CP的分离率一般在50—90%以上,[4.6.7]但在正常的胃和十二指肠活检标本中却很少能查出此菌。曾有报道,让志愿者吞服10~9个CP后,引起低胃酸性胃炎,持续时间约2周,病理学检查和     

抗K物质单克隆抗体的制备

速激肽族肽,包括K物质、P物质、神经素B等都具有神经递质的功能,它们越来越引起人们的关注。免疫学方法诸如:放射免疫测定法、免疫组织化学法等对神经肽的分布、定位和生物学功能等方面的研究提供了极大的方便。我们以K物质-甲状腺球蛋白偶联物免疫动物——Wistar大鼠和Balb/c小鼠。Wistar大鼠对K物质-甲状腺球蛋白的免疫应答能力显著高于Balb/c小鼠。通过Wistar大鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行异种细胞融合,获得了一株稳定地分泌抗K物质的单克隆抗体的细胞系(SE-1)。用RIA检测该单克隆抗体的特异性,除与P物质有一些交叉外,与其余我们所用的脑肽均不反应。     

抗胆汁螺杆菌单克隆抗体的制备

目的制备抗胆汁螺杆菌单克隆抗体（McAbs）。方法用胆汁螺杆菌B2m株皮下免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行融合。以酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选抗胆汁螺杆菌单克隆杂交瘤细胞株并初步鉴定其特异性;免疫印迹试验测定单抗所结合的抗原表位;免疫双向扩散试验确定IgG亚类;腹腔接种法、辛酸-硫酸铵盐析法大量制备、纯化单克隆抗体。结果经过ELISA筛选获得11个阳性杂交瘤细胞株,其效价最高达1：4×10^5以上,并与实验动物常见的15种病原菌呈阴性反应;IgG亚类为IgG2a和IgG2b;免疫印迹试验显示,6株（A-F）与胆汁螺杆菌大约相对分子质量（172、0、21、30、52、66）×10^3的抗原特异结合,5株（G-K）皆与胆汁螺杆菌、幽门螺杆菌等三种螺杆菌大约相对分子质量（52、82）×10^3的抗原呈阳性反应,表明A-F株针对的是胆汁螺杆菌特异性抗原,G-K株可能具有属特异性。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,所结合的抗原为胆汁螺杆菌或螺杆菌的免疫优势抗原,为进一步的种、属生物学特性研究、菌株分型及血清学检测方法建立等奠定了基础。     

抗iLRP单克隆抗体的制备和鉴定

为了研究抗iLRP (Immature laminin receptor protein)单克隆抗体在免疫治疗中的应用,本研究采用重组iLRP对6~8周龄BALB/c雌性小鼠进行免疫,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合,在HAT (Hypoxanthine aminopterin thymidine)半固体培养基上挑选分离明显的细胞克隆于96孔板培养后,取上清液通过ELISA法进行克隆筛选,初次筛选得到23株阳性克隆,复筛后得到13株稳定分泌抗体的细胞株。抗体类别鉴定显示,其中9株为IgM,3株为Ig G1,1株为IgG2a,轻链类型都为κ型。其中1株IgG1和IgG2a用于制备小鼠腹水,经Protein-G柱纯化,SDS-PAGE检测抗体纯度,Western blotting验证抗体特异性。结果表明,抗体纯度均大于90%,并与i LRP有明显的特异性结合。此结果为后续的深入研究提供了一套完整有效的抗iLRP单克隆抗体生产和鉴定的程序,对以iLRP为治疗靶点的单克隆药物研究以及最近兴起的CAR-T (Chimeric antigen receptor modified T cell)免疫治疗具有积极的意义。     

抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备

目的:制备分泌特异性抗人甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为建立高灵敏度的Tg检测方法做准备。方法:以天然人源甲状腺球蛋白为抗原经皮下免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体,并对其进行特异性鉴定,建立检测Tg的双抗体ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)夹心法。结果:获得7株可稳定分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与Tg抗原有良好的特异性反应。建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性可达1 ng/mL。结论:成功制备了抗人Tg单克隆抗体并建立了检测人Tg双抗体夹心ELISA方法,为进一步研发Tg快速诊断试剂盒提供了原料。