反相高压液相色谱折叠重组人白细胞介素-2

重组人白细胞介素２（ｒｈＩＬ２）基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过菌体发酵和收集、超声破菌、包涵体抽提、稀释透析初步复性、反相高压液相色谱纯化,终产物纯度大于９９％。反相高压液相色谱不仅可以纯化ｒｈＩＬ２,且使产物的总活性提高７９～９倍,比活性提高１４～１８倍,达到１５×１０７ｕ／ｍｇ蛋白质,蛋白得率为５０％～５６％。结果表明,反相高压液相色谱具有纯化和显著提高ｒｈＩＬ２折叠效率的双重功效,为非ＳＤＳ变复性法生产ｒｈＩＬ２提供了简便有效的方法     

反相高压液相色谱折叠重组人白细胞介素-2

重组人白细胞介素-2(rhIL-2)基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过菌体发酵和收集、超声破菌、包涵体抽提、稀释透析初步复性、反相高压液相色谱纯化,终产物纯度大于99％。反相高压液相色谱不仅可以纯化rhIL-2,且使产物的总活性提高7．9～9倍,比活性提高14～18倍,达到1.5×10⁷u／mg蛋白质,蛋白得率为50％～56％。结果表明．反相高压液相色谱具有纯化和显著提高rhIL-2折叠效率的双重功效,为非SDS变复性法生产rhIL-2提供了简便有效的方法。     

重组人白细胞介素-6的纯化

重组人白细胞介素－６（ｒｈＩＬ－６）在工程菌ｐＢＶ２２０／ｒｈＩＬ－６／ＤＨ５ａ中以包涵体形式高效表达。ｒｈＩＬ－６经过工程菌体破碎、包涵体分离及抽提、复性、色谱分离后得到高度纯化。纯化产物纯度９５％,具有良好的生物学活性     

疏水层析纯化人重组白细胞介素－4

应用疏水层析对大肠杆菌表达的人重组白细胞介素－４（ｒｈＩＬ－４）进行了纯化,含有ｒｈＩＬ－４的包涵体,经洗涤、变性、复性后,以Ｂｕｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ层析,得到了高纯度的ｒｈＩＬ－４．纯度达９７％;回收率为３２％;比活性为２×１０~７Ｕ／ｍｇ,讨论了ｒｈＩＬ－４疏水层析的条件,并对不同的方法纯化白细胞介素－４进行了比较．     

大肠杆菌表达重组人白细胞介素-9的纯化及部分性质

表达重组人白细胞介素－９（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－９ｒｈＩＬ－９）的大肠杆菌经破碎、包涵体洗涤、裂解提取、凝胶过滤和离子交换色谱分离,得到了电泳纯的ｒｈＩＬ－９,回收率６６％,分子量与理论值相符,有刺激小鼠骨髓巨核系集落生成的活性．为ｒｈＩＬ－９的大规模制备及更深入的研究奠定了基础     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子包涵体提取、复性和纯化的研究

由基因工程大肠杆菌表达的重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）以包涵体的形式存在于细胞中,通过破菌、洗涤获得包涵体,再经过溶解、凝胶过滤、复性、疏水和离子交换柱导析得到了均一的产品,经高压液相和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳测定纯度均大于９８％,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的比活为３．２×１０＾７ＩＵ／ｍｇ,纯化获得的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ为一酸性蛋白,等电点约为５．２,ＮＨ２－末端有２０个氨基酸序列测定结果     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

离子对反相HPLC测定小鼠骨髓BFU—E,CFU—E中PRPP合成酶活性

采用离子对反相高效液相色谱法（ＩＰｒＨＰＬＣ）的单液等度洗脱,测定了小鼠骨髓红系爆增性集落形成单位（ＢＦＵ－Ｅｓ）与红系集落形成单位（ＣＦＵ－Ｅｓ）的ＰＲＰＰ合成酶活性。方法学研究表明,加入离子对试剂硫酸氢四丁基铵（ＴＢＡＨＳ）后,ＡＤＰ谱峰分离完全,其反应增加量易于计算。本法的批内变异系数平均值为－２．３０％￣－１．０６％与１．０６％￣２．３０％,平均相对偏差为０．８１％￣１．７４％,回收率为９     

重组人白细胞介素6的制备

我们采用本院基础医学研究所组建的ＩＬ-６工程菌Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５ａ（ｐＢＶ-ｈｌＬ－６）,在选定的培养基及ｐＨ值下,采用３０升发酵罐进一步观察了工程菌的生长和ｒＩＬ－６的表达,确定了发酵工艺条件。在此条件下连续进行了三批次的培养试验。结果表明,工程首的生长密度达到２．５１±０．０２ｇ［干重］／Ｌ［发酵液］,ｒＩＬ-６产率为１８２．４±２．０ｍｇ／ｇ［干重］。ｒＩＬ-６以包涵体形式表达于大肠杆菌细胞中,破菌后选用非离子型去垢剂或尿素等变性剂提取包涵体中的杂蛋白,可使ｒＩＬ-６的纯度达到７０．１±１．３％,收率为７１．９±１．９％。洗涤后的包涵体,经过凝胶柱纯化和复性,ｒＩＬ-６纯度达到９５％以上,柱纯化的收率为７２．３±０．９％;采用依赖ＩＬ-６,小鼠杂交瘤细胞系７ＴＤ１及ＭＴＴ比色法测定生物活性,ｒＩＬ-６比活性达２×１０８Ｕ／ｍｇ。     

丙型肝炎病毒核心重组抗原C27的纯化

高效表达了ＨＣＶ核心区基因抗原之后,对表达蛋白Ｃ２７进行了纯化,经研究,重组蛋白是以包涵体形式存在于宿主菌内的。Ｃ２７重组蛋白分别经过包涵体洗涤、ＤＥＡＥ阴离子交换层析和Ｓ－２００分子筛两步柱层析纯化之后,纯度大于９５％,纯化得率为５３．２％,总回收率为１７．９％,纯化工艺流程简单、得率高,适合向规模化生产发展。     

猪肺源肝素的分离纯化及其成分鉴定

本文报告了从猪肺中用改进后的碱性氯化钠盐解法萃取的粗肝素为原料,以新型分离材料ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ分离纯化,并与ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０进行比较,前者使粗肝素比活由１３．９ＵＳＰ／ｍｇ提高到２０３．６４ＵＳＰ／ｍｇ（美国药典单位）,纯化系数达到１４．６５,回收率达８６．９３％,而通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０分离纯化后的肺肝素其比活性提高到１０２．１０ＵＳＰ／ｍｇ,纯化系数为７．３５,回收率为７２．２２％,其比活性、总活性回收率及纯化系数等,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ均优于ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０。纯化相当量粗肝素所需时间、次数亦大大减少,并用醋酸纤维薄膜电泳,高效液相色谱进行性质和纯化鉴定,用红外光谱进行基团分析鉴定。     

丙型肝炎病毒核心重组抗原C_（27）的纯化

高效表达了ＨＣＶ核心区基因抗原之后,对表达蛋白Ｃ_（２７）进行了纯化。经研究,重组蛋白是以包涵体形式存在于宿主菌内的。Ｃ_（２７）重组蛋白分别经过包涵体洗涤、ＤＥＡＥ阴离子交换层析和Ｓ－２００分子筛两步柱层析纯化之后,纯度大于９５％,纯化得率为５３．２％,总回收率为１７．９％。纯化工艺流程简单、得率高,适合向规模化生产发展。     

Nm23-H1/NDPK-A基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化的研究

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增人二磷酸核苷激酶Ａ亚基（ＮＤＰＫ－Ａ）基因,即ｎｍ２３－Ｈ１／ＮＤＰＫ－Ｋ基因的编码序列,经序列分析后,定向克隆于表达质粒载体ｐＢＶ２２０,在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达出重组人ＮＤＰＫ－Ａ．表达产物为可溶性的非融合蛋白,占菌体总蛋白４２％．斑点ＥＬＩＳＡ法鉴定表明表达产物与ＮＤＰＫ－Ａ标准抗血清呈阳性反应．以ＤＥＡＥ纤维素弱阴离子交换层析、ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ染料亲和层析结合高效液相排阻色谱技术纯化ｒＮＤＰＫ－Ａ,得纯度为９６．７％的目标蛋白．以反相高效液相色谱法进行酶活性分析,表明纯化的ｒＮＤＰＫ－Ａ能催化ＡＴＰ＋ＵＤＰ＝ＡＤＰ＋ＵＴＰ的反应,比活性为８００Ｕ／ｍｇ蛋白．     

安徽虫瘟霉菌株的强毒杀蚜应与侵染速率

报道安徽虫瘟霉（Ｚｏｏｐｈｔｈｏｒａ ａｎｈｕｉｅｎｓｉｓ）菌株Ｆ９７０２８对桃蚜（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）的强毒杀蚜活性。以７个孢子剂量（０．４￣１０．４个孢子／ｍｍ＾２）接种２￣３龄若蚜（５２￣８６头／剂量）,连续观察７ｄ,所获数据经时间－剂量－死亡率模型模拟分析,接种后第３￣７ｄ的ＬＤ５０分别为３４．８、８７、１．５、０．７和０．４个孢子／ｍｍ＾２;在所有剂量范围内ＬＴ５０为２．９￣６     

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立

基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上,重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰,修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性,建立了一条简便、稳定,适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体,８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体,稀释复性蛋白,之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白,每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明,对甲硫氨酸的去除彻底,用于人体时可能具有较小的免疫原性和毒性     

鲈鱼生长激素的分离及其生物活性鉴定

运用葡聚糖凝胶Ｇ－１００过滤和反相高儿液相色谱纯化两步法,首镒从鲈鱼脑垂体中分离出鲈鱼生长激素,通过ＳＤＳ－聚丙烯凝胶电泳测得鲈鱼非还原性的和还原性的生长激素分子量分别为１９．２和２０．７ｋＤ;等电聚焦证实鲈鱼生长激素等电点为７．１５。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹反应证实,鲈鱼生长激素具有与大麻哈鱼生长激素抗体发生特异性免疫交叉反应的特性,而与大麻哈鱼催乳素和生长催乳素抗体无免疫交叉反应。     

高效液相色谱法测定酵母中麦角固醇含量

本文建立了酵母中麦角固醇含量高效液相色谱测定方法。其色谱条件为,色谱柱ＨＹ Ｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ１８ ５ｕ反相柱,流动相为甲醇：水（９７：３）,紫外检测波长为２８３ｎｍ。酵母样加碱乙醇皂化、提取、洗涤、蒸干、定量测定。结果表明：标准曲线范围是０．０２－０．８ｍｇ／ｍｌ线性良好,最低限量为０．０１ｍｇ／ｍｌ;日内及日间ＲＳＤ（ｎ＝４）分别在２．１－４．０％和２．４－４．８％,回收率为９６．０－９     

真核细胞基因工程产物人生长激素的纯化研究

应用反相高效液相色谱法（ＲＰ－ＨＰＬＣ）对真核细胞基因表达产物人生长激素进行了纯化研究,发现在７１．６７％的乙晴浓度下人生长激素可有效地与其它杂蛋白分离,乙晴与人生长激素的短时间接触不影响其放射免疫活性．     

人血红细胞酪氨酸蛋白磷酸酶（PTPP）的研究Ⅱ·胞浆PTPP的分离纯化及其主要性质

人血红细胞胞浆部分经（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４沉淀,ＤＥＡＥ－纤维素（ＤＥ５２）柱层析,磷酸纤维素柱层析（Ｐ１１）得到部分纯化的ＰＴＰＰ,产率：５．７％,提纯１０７５倍。以（３２）￣Ｐ－Ｔｙｒ－Ｐｏｌｙ（Ｇ_４：Ｔ）作底物,测得其表征Ｋｍ约为０．５－０．８μｍｏｌ／Ｌ,该酶的最适ｐＨ和最适温度分别为７．０－７．８及３７－４０℃。Ｚｎ￣（２＋）等二价金属离子及Ｎａ_３ＶＯ_４等酸根基团对其活性有明显的抑制作用;ＥＤＴＡ、甘油及ＤＴＴ、巯基乙醇等则对其有强烈激活作用;而氟化物、酒石酸等对ＰＴＰＰ活性基本无影响。此外,某些蛋白质、氨基酸、核苷酸及抗肿瘤药物等对ＰＴＰＰ活性也都有不同程度的影响。特别是一些ＰＫｓ及ＰＰｓ在体外对ＰＴＰＰ活性也具有不同的作用。     

江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶A2基因的表达

将江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２基因克隆至表达载体ｐＢＬＭＶＬ２,转化入大肠杆菌ＲＲ１,经过温敏诱导,ＳＤＳ－Ｐ;ＡＱＧＥ检测,在约１４ｋＤ处有一表达条带。表达产物酸性磷脂酶Ａ２约占细菌蛋白总量的３０％,并以包涵体的形式存在。纯化包涵体后,将产物变性,复性,然后用ＦＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ＾ＴＭ１２纯化,产物经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测只有单一条带。