山羊β-乳球蛋白基因5′侧区的克隆、测序和序列分析

采用ＰＣＲ方法,首次从中国山羊肝组织扩增出β乳球蛋白（βＬａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ,βＬＧ）基因的５′侧区８６７ｂｐ片段,其中包括７７０ｂｐ的启动子和９７ｂｐ的部分第一外显子,再克隆测序。然后,我们用计算机分析比较了山羊βＬＧ基因的５′侧区与绵羊的和乳牛的同源性,分别为９４６％和８８％。还发现上述三者该区域中的转录因子结合位点及其序列都很相似。而已知绵羊与乳牛的βＬＧ基因启动子可指导外源基因在转基因动物中组织特异性地高效表达,这提示了山羊βＬＧ基因启动子可能亦足以指导外源基因高效表达。本工作为以后用山羊βＬＧ基因启动子,指导外源基因在转基因动物乳腺中高效表达打下了一定的基础     

山羊β-乳球蛋白基因5’侧区的克隆、测序和序列分析

采用PCR方法,首次从中国山羊肝组织扩增出β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,βLG)基因的5’侧区867bp片段,其中包括770bp的启动子和97bp的部分第一外显子．再克隆测序。然后,我们用计算机分析比较了山羊β相似文献   

葡萄叶绿体rbcL基因的结构分析

以玫瑰香葡萄（Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．）为材料,克隆了含有叶绿体ｒｂｃ Ｌ基因的３．１ ｋｂ Ｂａｍ ＨⅠ片段,构建了该基因的限制性酶切图谱,测定了该基因的核苷酸序列。所测的核苷酸序列总长度为２００４ ｂｐ,其中基因的编码区为１４２８ ｂｐ,编码一个含４７５ 个氨基酸的蛋白质,其分子量约为５３ ｋＤ;测定基因的５上游含启动子的部分共３５８ ｂｐ,包括－ １０ 区（ＴＡＡＡＡＴ）、－ ３５区（ＴＴＧＣＧＣ）和ＳＤ 序列（ＧＧＡＧＧ）;基因的３下游区共２１８ ｂｐ,含有３ 个转录茎环终止结构。玫瑰香葡萄ｒｂｃ Ｌ基因编码区的核苷酸序列与烟草、矮牵牛、菠菜、苜蓿、水稻和玉米之间的同源性分别为９１．５％ 、９１．４％ 、９０．２％ 、８９．８％ 、８６．３％ 和８４．５％ ;推导出的氨基酸序列的同源性分别为９２．２％ 、９１．６％ 、９２．２％ 、９３．７％ 、９３．５％ 和９０．１％ 。     

马铃薯class I patatin基因家族的一个新亚型

马铃薯ｃｌａｓｓⅠ与ｃｌａｓｓⅡｐａｔａｔｉｎ基因是具有不同组织表达专一性的一个多基因家族。用马铃薯ｃｌａｓｓⅡｐａｔａｔｉｎ启动子为探针,从中国马铃薯栽培品种“东农３０３”基因文库中筛选到一个ｃｌａｓｓⅠｐａｔａｔｉｎ基因。测定其ＤＮＡ顺序１．８ｋｂ;它包括ｐａｔａｔｉｎ基因５＇侧翼区１４０７ｂｐ、结构基因３６３ｂｐ。根据５＇端非翻译区顺序,它属ｃｌａｓｓⅠｐａｔａｔｉｎ基因。该基因的５＇侧翼区     

水稻蜡质基因5＇上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻蜡质基因（ｗａｘｙ）５＇上游调控区中存在的顺式作用元件,我们将水稻ｗａｘｙ基因翻译起始声、（ＡＴＧ）５＇上游３．４ｋｂ（－２１１８～＋１２９１ｂＰ）片段经外切核酸酶ＥｘｏⅢ部分酶解,得到一系列５＇端缺失的片段。将这些缺失片段分别与ｇｕｓ基因编码区连接,构建成融合质粒,经ＰＥＧ介导引入水稻原生质体,２６℃培养４８ｈ后,定量测定ＧＵＳ酶活力,并以同时导入的由３５Ｓ启动子指导的荧光素酶（ＬＵＣ）基因表达的酶活力作为内对照。结果表明,ＧＵＳ酶活性随５’上游调控区长度的减少而逐渐减弱。由─８６１ｂｐ缺失至─６４０ｂＰ时,ｇｕｓ基因表达水平有较明显的降低,推测在该区域中可能存在一个顺式作用元件区。     

粘虫核型多角体病毒凋亡抑制基因的定位,序列和启动子结构

以ＡｃＮＰＶ凋亡抑制基因ｐ３５为探针,与ＬｓＮＰＶＤＮＡ的限制性片段和ＬｓＮＰＶＤＮＡＥｃｏＲＶ片段杂交,发现ＥｃｏＲＶ５．５ｋｂ片段有强烈的杂交信号。将此片段亚克隆后,测定了１２４４ｂｐ序列,发现一个完整的ＯＲＦ,推导的３０２个氨基酸与ＡｃＮＰＶｐ３５蛋白有７０．４％的氨基酸同源性,证明所测ＯＲＦ为ＬｓＮＰＶ的ｐ３５基因。结构分析发现其５′端有早期基因启动子元件ＧＣ、ＡＣＧＴ和ＴＡＴＡｂｏｘ。有２２ｂｐ的顺向重复序列,包括由两个重叠的ＴＡＴＡｂｏｘ和上下游两个ＡＣＧＴｍｏｔｉｆ组成的两套启动子元件,这些结构特征与ＡｃＮＰＶ的凋亡抑制基因十分相似。     

人分裂细胞核抗原基因片段的筛选、测序及对启动子的分析

经６．６×１０５个克隆筛选,从装在λ噬菌体载体Ｃｈａｒｏｎ３０中的人基因库中筛选到了一个含人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因的克隆。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析插入基因长约１４ｋｂ,有较长的５＇上游区,但３＇端缺少一部分。经亚克隆和测序已确定从５＇上游１２６３ｂｐ到３＇端与λ载体接点共４９６９ｂｐＰＣＮＡ基因片段的核苷酸序列。将ＰＣＮＡ基因启动子核苷酸序列与ＤＮＡ聚合酶α,拓扑异构酶Ⅱα,胸苷酸激酶基因的启动子进行比较有３０％以上同源性,具有“看家基因”特征。在转录起始点的５＇上游几百ｂｐ的范围内都有与ＣＡＴ,ＳＰ１,Ｅ２Ｆ,ＮＦＨＢ,Ｏｃｔ１和ＡＴＦ等转录因子的结合位点相似的核苷酸序列。     

与人体ε-珠蛋白基因5''''旁侧正调控元件(ε-PREI)专一结合的调控因子的初步研究

人体ε－珠蛋白基因５′旁侧ＤＮＡ序列对该基因时空表达与调控起着十分重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法,ＤＮａｓｅＩ足印法和Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析法发现在胚胎型红白血病细胞株Ｋ５６２细胞中有一个特异的核蛋白因子（简称ε－ＳＳＰ,其分子量大约为８０ｋＤ）,它能专一地与人体ε－珠蛋白基因５′旁侧一个红细胞专一和发育时期特异的正调控元件（ε－ＰＲＥＩＩ,－４４６ｂｐ到－４１９ｂｐ）相结合。竞争实验表明该因子与ε－ＰＲＥＩＩ的结合能被人体ε－珠蛋白基因启动子区ＤＮＡ片段（－１７７ｂｐ到＋１ｂｐ）所竞争;同时也能被人体β－类珠蛋白基因远侧端调控元件ＬＣＲ中的ＤＮａｓｅＩ超敏感点Ｉ核心区ＤＮＡ片段（－１０９６５ｂｐ到－１０６８１ｂｐ）与超敏感点ＩＩ核心区ＤＮＡ片段（－１４９９３ｂｐ到－１４７１８ｂｐ）所竞争。我们的结果提示了ε－ＳＳＰ不仅是一个与红细胞专一性和发育时期特异性相关的反式调控因子,而且它可能介导远侧端调控元件（ＬＣＲ）与近侧端调控元件启动子之间的相互作用,共同调节ε－珠蛋白基因在胚胎期的表达。     

粘虫核型多角体病毒多角体蛋白基因结构和序列的研究

测定了粘虫核型多角体病毒（Ｌｅｕｃａｎｉａｓｅｐａｒａｔａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,ＬｓＮＰＶ）两个ＥｃｏＲＶ片段的共１２０１ｂｐ序列,发现了一个７１４ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ）,根据其与多种ＮＰＶ多角体蛋白基因（ｏｃｕ）同源性的比较和５＇端典型的１４ｂｐ保守序列,说明此ＯＲＦ即为ＬｓＮＰＶ的ｏｃｕ基因。根据核苷酸序列预测的多角体蛋白有２４６个氨基酸,其中酸性和碱性氨基酸数相等,疏水氨基酸含量很高,氨基酸组成中以谷氨酸（Ｇｌｕ）含量最高,谷氨酰胺和半胱氨酸含量最低。编码区碱基同源性与ＭｂＮＰＶ最高,为９７．０％;氨基酸同源性与ＭｂＮＰＶ最高,为９７．５％。密码子偏爱选用以第三个碱基为嘧啶的密码子。二级结构分析表明,α－螺旋（Ｈ）和β－折叠（Ｓ）相等,β－转角含量是Ｈ和Ｓ含量之和。     

玉米19kD醇溶贮藏蛋白基因启动子种子特异性表达控制区段的分析

为研究玉米（Ｚｅａｍａｙｓ　Ｌ．）１９ｋＤ醇溶贮藏蛋白（ｚｅｉｎ）基因启动子种子特异性表达的控制区段,将全长６９４ｂｐ的启动子进行５’端缺失,共得到６个缺失突变体,长度分别为４８８ｂｐ、３７８ｂｐ、３０２ｂｐ、１５２ｂｐ、１２４ｂｐ和８５ｂｐ。将６个片段分别与报告基因ｇｕｓ连接构建成表达载体ｐＤＧＢ系列,经土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导转化,引入烟草。ＧＵＳ活性检测证明,４８８ｂｐ启动子片段能促使ｇｕｓ基因在种子中特异表达。３７８ｂｐ、３０２ｂｐ、１５２ｂｐ和１２４ｂｐ片段启动子引导的ｇｕｓ基因在烟草根、叶柄、种子中均可表达。     

奶山羊β-乳球蛋白基因5＇、3＇调控区的克隆和序列分析

目的：克隆奶山羊β-乳球蛋白（BLG）基因5＇、3＇调控区,并对其进行序列分析。方法：从徐淮奶山羊组织中提取基因组DNA,采用高保真长模板PCR法克隆得到奶山羊BLG基因4.2kb的5＇调控区和1.8kb的3′调控区;将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定和序列测定验证克隆的正确性。结果：部分序列分析表明,奶山羊BLG基因5＇区与GenBank中登录的山羊和绵羊BLG基因5＇区的同源性分别为100%和95%,3＇区的同源性分别为99%和93%;克隆得到的奶山羊BLG基因调控区与山羊BLG伪基因显著不同,二者5＇区和3＇区的同源性分别为83%和88%。结论：克隆得到的奶山羊BLG基因调控区可用于构建乳腺特异性表达载体,用于外源基因在转基因动物乳腺中的高效表达。     

组织纤溶酶活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

组织纤溶酶原激活剂（ｔＰＡ）是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体－长效组织纤溶酶原激活剂（ＬＡｔＰＡ）的ｃＤＮＡ作为目的基因,将它插入羊β－乳球蛋白（ＢＬＧ）基因起始密码之前,使ＬＡｔＰＡ的转录、翻译受控于ＢＬＧ基因的５＇、３＇序列,再将所构建的ＢＬＧ－ＬＡｔＰＡ用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹鉴定,获得２只ＬＡｔＰＡ基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有     

HMG蛋白质与人ε—珠蛋白基因5‘旁侧调控元件DNA相 …

ＨＭＧ蛋白质是一类在染色质内含量极为丰富的非组蛋白质,它们在染色质的结构与功能中起着重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法和ＤＮａｓｅＩ足迹法分析了ＨＭＧ蛋白质与人ε－珠蛋白基因５＇旁侧调控元件ＤＮＡ之间相互作用的情况。结果表明ＨＭＧ蛋白质（１／２）既能与两个正调控元件（－５３５￣－４５３ｂｐ和－４４６￣－４１９ｂｐ）ＤＮＡ相结合,也能与启动子（－１７７￣＋１ｂｐ）ＤＮＡ相结合;而ＨＭＧ蛋白质（１４／     

转人血清白蛋白基因试管牛的研究

构建了含人血清蛋白（ｈＡＬＢ）的基因的ｃＤＮＡ全,序列,内含子１以及山羊酷蛋白基因启动子和５＇端上游调控序列在内的的乳腺载体ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＡＬＢｍ,并通过显微将导入经过体外受精（ＩＶＦ）的奶牛受精卵中,体外培养到桑棋胚后期,取出少许细胞,应用巢式ＰＣＲ对其进行目的基因整合及性别的预鉴定,将１０枚整合胚移植于８头受体母牛,结果有３头妊娠,受孕率为３７．５％（３／８）,其中２头于妊娠中期流产,另     

番茄抗病基因Cf9的3‘UTR区含有内含子序列

从番茄抗病品种“中杂９号”基因组ＤＮＡ中扩增并克隆了番茄抗叶霉病基因Ｃｆ９。序列分析结果表明,该基因全长２７５１ｂｐ,含有一个编码８６３个氨基酸的开放阅读框架。在该基因的３＇ＵＴＲ区发现了一段未曾报道的内含子序列,长１１５ｂｐ,它所处的位置与番茄另一个抗叶霉病基因Ｃｆ２内含子的位置相似,其５＇和３＇边界序列为一重复序列,ＴＣＣＡＧＧ（Ｔ）ＡＴＴＣ,并与Ｃｆ２基因内含子边界序列高度同源。与已报道的Ｃ     

籼稻蜡质基因5＇上游区与GUS基因编码区融合基因的构建和在水稻中的瞬间表达

为了鉴定水稻蜡质基因５＇上游区的顺式作用因子与研究它们在组织专一性表达中的作用,我们对籼稻品种２３２的蜡质基因５＇上游－１１５至－２１２０的区域进行了顺序测定,并将此基因的５＇上游区同报告基因ＧＵＳ构建成融合基因,用基因枪粒子轰击的方法将此融合基因导入水稻未成熟种子的幼胚和糊粉层细胞中,瞬间表达检测的结果表明,我们构建的融合基因中蜡质基因５＇上游区的长度已足以使ＧＵＳ基因在上述组织中表达。     

优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略 …

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５＇端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ＇的５＇端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的－８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,     

水稻蜡质基因5‘上游区中31bp序列增强基因表达的作用

为研究水稻腊质基因（ＷＸ）５‘上游区中一个与胚乳核蛋白绫的３１ｂｐ在基因表达中的作用,将一系列包含或不包含此序列的长度不同的Ｗｘ启动区与β－葡萄糖苷酸酶基因（ＧＵＳ）编码区连接,成嵌合质粒。针这些质粒通过杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织发化产生转朱。分别测定抗性愈伤组织中与转基因株未成熟种子胚乳中的ＧＵＳ酶活性,结果表明含有３１ｂｐ序列的比不含此序列的ＷＸ启动区使ＧＵＳ报告基因的表达水平高出２～３倍。     

cIts857基因的克隆,修饰及温敏诱导表达载体

从噬菌体λＤＮＡ克隆出９９０ｂｐ的ｃＩｔｓ８５７基因,经缺失,点突变等修饰改造和ＤＮＡ序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型ｃＩｔｓ８５７基因（７７０ｂｐ）。进而利用它大肠杆菌表达载体ｐＢＬＭＶＬ２和一套含３种不同阅读框架Ｉｉｎｋｅｒ区的表达载体ｐＢＬＭＦＶ４、５Ｂ、６。上述表达载体,用于表达人工合成的牛生长激素、人干扰素－γ△Ｃ－１３和酵母ｐｈｏ８５等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表 …

通过ＰＣＲ方法从羊肝总ＤＮＡ中获得了羊－β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因第一和第二内含子,以羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’区５ｋｂ为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体载体。对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测,获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ的转基因小鼠,整合率为３２％。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明,在一些转基因鼠乳