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1.
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纤维蛋白显影方法是经SDS-PAGE将不同分子量的纤溶酶原激活剂(PA)分开,然后再转溶纤维蛋白板使之产生溶带而检测PA物质活性及分大小的方法,此法与Western印迹方法此具有检测更简便、灵敏、快速的特点,且是活性检测,但其分子量分析精度不如Wwestern印迹法。本研究用SDS-PAGE纤维蛋白自显影方法对本室表达的生组组织型-PA及突体N117Q  相似文献   

2.
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纤维蛋白显影方法是经SDS-PAGE将不同分子量的纤溶酶原激活剂(PA)分开,然后再转溶纤维蛋白板使之产生溶带而检测PA物质活性及分子大小的方法。此法与Western印迹方法比具有检测更简便、灵敏、快速的特点,且是活性检测,但其分子量分析精度不如Western印迹法。本研究用SDS-PAGE纤维蛋白自显影方法对本室表达的重组组织型-pA(rt-PA)及突变体Nll7Q/Nl84Q/△(K296——G302)及标准尿激酶(UK)和rt-PA进行了分析鉴定。  相似文献   

3.
用PCR方法扩增人微小纤溶酶原(Microplasmingen,mPlg)基因,再与表达载体重组.构造mPlg原核表达质粒并转化大肠杆菌。阳性克隆pSSE-mPlg经温度诱导表达,SDS-PAGE等方法证明表达产物的分子量约为29kDa。占全菌总蛋白的24%左右,并在菌内形成包涵体。经半胱氨酸再氧化法和空气氧化法复性。表达产物r-mPlg经SK作用后显示纤溶活性。同时对蛋白质浓度、复性时间等因素对复性的影响进行了初步探讨。  相似文献   

4.
t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
应用PCR方法,在t-PA cDNA5'端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTE-Y,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选t-PA cDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDS-PAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定t-PA的活性。Mut^s表型菌表  相似文献   

5.
杭州虻纤溶酶的纯化及其生物活性分析   总被引:3,自引:0,他引:3  
经过75%硫酸铵沉淀、SephadexG-75凝胶过滤层析、DEAE Sephadex A-25离子交换层析、B enzamide-Sepharose4B亲和层析,从杭州虻(Tabanus hongchowensis)腹部匀浆液中分离纯化出分子量约为36.5kD的纤溶酶THFE。经纤维蛋白平板测定表明,THFE既具有纤溶酶作用,又具有激活纤溶酶原的作用。THFE能分解纤溶酶原激活剂的生色底既具有纤  相似文献   

6.
为研究和比较纤深酶原激活剂抑制物2型(plasminogen activaor inhibitor type 2,PAI-2)及其突变体的生物化学性质,用PCR、体外定点突变技术构建PAI-2突变体PAI-2CD和PAI-2QcDNA,将突变体cDNA与原核表达载体重组并转化怕杆菌。经诱导表达,SDS-PAGE证实表达出相应蛋白质,均占全菌总蛋白的14%。Wetern印迹、溶圈抑制及纤维蛋白翻转板  相似文献   

7.
t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达   总被引:3,自引:0,他引:3  
应用PCR方法,在tPAcDNA5′端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTEY,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选tPAcDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDSPAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定tPA的活性。Muts表型菌表达产物活性最高为2500IU/ml,Westernblot证实表达产物具有天然tPA分子的免疫原性。  相似文献   

8.
玉米叶绿体偶联因子ε亚基基因(atpE)被克隆到载体pJLA505和pWA的多聚接头处,形成重组质粒pJLA505-atpE和pWA-atpE,转化E.coli,并进行温敏诱导表达研究。在大肠杆菌中温敏诱导的基因表达产物经SDS-PAGE测定,表达量达全菌蛋白质的30%以上.Western-blot分析结果表明温敏诱导的表达产物可特异性地与ε亚基抗体反应,在免疫双扩散中也观察到沉淀线。大肠杆菌表达的玉米叶绿体atpE基因产物以包含体形式存在于细菌中。经对包含体处理后;获得的粗产物可达80%以上纯度,并具有天然ε亚基蛋白质的生物功能.  相似文献   

9.
霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明,zot基因编码399个氨基酸,其中4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET-28(a+)构建表达质粒pET-ZOT,转化大肠檑菌BL21(DE3)筛有达菌株BLZOT。表达菌株经1mmol/LT IPTG诱导表达3-5h后,表达大量ZOT蛋白,并形成包涵体,经SDS-PAGE分析重组ZOT蛋白分  相似文献   

10.
用PCR方法从pPAIJ.7中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)基因,与pPUC18重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人PAI-2基因.PAI-2基因与表达载体pPIC9重组,构建受乙醇氧化酶1基因(AOX1)启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化GS115宿主菌,经表型筛选和PCR扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组PAI-2以分泌型表达,占分泌总蛋白的30%,具PAI-2抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗SDS复合物,具抑制纤溶的活性(91.4AIU/ml).对培养条件也进行了探讨.  相似文献   

11.
夏威环毛蚓纤溶酶的分离纯化及部分性质研究   总被引:6,自引:0,他引:6  
宋关斌  李清漪 《动物学报》1996,42(2):146-153
以夏威环毛蚓(Pheretima hawayana)为材料,采用磷酸盐缓冲液抽提、(NH4)2SO4分段盐析,离子交换树脂 D290、 Sephadex G-100和 DEAE-sephadex A-50三种连续柱层析方法得到一种在 PAGE上显示单一区带的纤溶酶组份。采用凝胶柱层析和 SDS-PAGE测其分子量为 12 000和 12300,由一条肽链组成。该酶具有强烈的纤溶活力和水解BAEE的活力,能直接作用纤维蛋白和间接激活纤溶酶原。其最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0。该酶水解BAEE的活力可被Na+、K+、Mg2+、Hg2+、金属离子和EDTA、巯基乙醇抑制,Ca+则有激活作用。该酶中性糖含量为5%,氨基酸组成中Arg、Len含量较多.  相似文献   

12.
为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶(SjGST)基因工程重组蛋白,以日本血吸虫(中国大陆株)cDNA为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,RT-PCR法扩增GST编码基因序列,将扩增产物连接pGEM-T克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒pBK-CMV中,转染大肠杆菌XL1-blue,经IPTG诱导后用SDS-PAGE分析表达效果。结果 RT-PCR法特异性扩增出日本血吸虫GST编码区基因片段,其  相似文献   

13.
用正常人胎肺细胞体外培养,从其培养液中分离纤溶酶原活化物(PA),通过CM-SephadexC-50层析,硫酸铵沉淀和Fibrin-Sepharose,Lysine-Sepharose亲和层析及SephadexG-50凝胶过滤等步骤,从10.5l条件培养液中分离纯化得到两种类型的纤溶酶原活化物,t-PA90μg,u-PA800μg.在还原条件下SDS-PAGE均显示单带,分子量t-PA为72kD,u-PA为54kD,纤溶比活分别为156000IU/mg蛋白和106000IU/mg蛋白.  相似文献   

14.
蚯蚓纤溶酶的纯化及稳定性研究   总被引:4,自引:0,他引:4  
蚯蚓纤溶酶(EPA)抽提液经30% ~70% 饱和度的(NH4)2SO4 盐析、DEAE—纤维素柱层析、Sephadex G-75葡聚糖凝胶过滤等纯化步骤,得到了具有纤溶活性的洗脱峰,置凝胶电泳后,得到四个活性组分,它们经50℃保温6h,活力上升64% ;在2 m ol/L盐酸胍存在时,活力仅保存7.2% ,当其浓度降低时,活力可恢复至90% ;在1% SDS存在时,活力仅保存12.1% ,但当SDS除去时,活力又可恢复。因此,盐酸胍、SDS均为EPA 可逆性抑制剂。另外,EPA 中含有较高的糖链(占总量的45% ),具有良好的抵抗自水解作用。  相似文献   

15.
根据基因库中的顺序,设计了胶质细胞源神经营养因子(GDNF)基因的PCR引物,以此从人基因组DNA中扩增并克隆了GDNF的编码序列,经DNA测序确认后,该片段克隆到表达质粒pET-3a中,转化大肠杆菌BL21(DE3).培养的重组菌经IPTG诱导,在T7启动子调控下表达出hGDNF蛋白.经电泳分析表明GDNF主要存在于细菌包涵体中.从培养菌中制备包涵体,经充分洗涤,溶解于含8mol/L尿素的变性缓冲液中.经SP-Sepharose柱层析分离,梯度洗脱,以15%SDS-PAGE检查含GDNF的部分.将含单体GDNF部分进行复性,再次用SP-Sepharose离子柱分离同源二体GDNF.最后经SDS-PAGE制备电泳纯化,纯度大于95%.经N端测序表明序列正确.经测定,每升培养菌可得约10mg纯化的GDNF.  相似文献   

16.
蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定   总被引:10,自引:0,他引:10  
以新鲜蚯蚓为原料,经过保温抽提、乙醇沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析、Lysine-Sepharose4B亲和层析以及SDS-PAGE制备电泳等纯化步骤,得到一种纯度达95%以上的蝗蚓纤溶酶,该酶具有强烈的溶解纤维蛋白折作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为900UK单位/毫克蛋白,TAME法测得其比活性为25000单位/毫克蛋白,酶学性质研究表明其最适反应温度为65  相似文献   

17.
利用 D N A 重组技术和定位删除技术,将组织型纤溶酶原激活剂(t P A)的 A 链( Serl Thr263)基因与尿激酶原(pro U K)的 B链( Ser138 Leu411)基因相连,得到嵌合分子基因tu pa,并在昆虫杆状病毒系统中进行表达,表达量可达 500 I U/m l.经单克隆抗体免疫亲和层析纯化细胞表达上清液,得到tu P A 嵌合分子,其比活为 200 000 I U/m g 蛋白. S D S P A G E 及 W estern blot 鉴定证明此表达产物分子量约为 60 k D,与预期值相符.纤维蛋白平板测活及纤维蛋白亲和性分析初步证明,此嵌合分子的溶纤活性与pro U K 相近,而纤维蛋白亲和性高于 pro U K.  相似文献   

18.
利用大肠杆菌表达的重组纤溶酶原激活物抑制因子-1(rPAI-1)具有许多与天然PAI-1相同的性质,rPAI-1对u-PA抑制活性研究的内容包括:几种化学物质(盐酸胍、尿素、硫氰酸钾、SDS、氯化钠等)对rPAI-1的激活作用、盐酸胍激活rPAI-1的浓度与温度效应、显色底物法和SDS-PAGE纤维蛋白自显影对rPAI-1活性的测定、活性态rPAI-1向潜状态的转变及其与盐浓度和pH值的关系。  相似文献   

19.
黄滨  唐慰萍 《病毒学报》2000,16(3):258-261
以Epstein-Barr病毒(EBV)DNA聚合酶为抗原,建立了简便、快速、敏感和特异的鼻咽癌诊断方法。构建原表达载体pRSET-DNA聚合酶及其亚克隆PRSET-A1和BL21(DE3)中表达的产物,经Western-blot检测其抗原性并用于检测鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)病人血清中的抗体。在DPC病人血清中存在抗EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体,并证明  相似文献   

20.
利用PCR扩增得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆pGEM-T构建成GM-CSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对72RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴  相似文献   

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