重组人肿瘤坏死因子α衍生物3a(rh-TNFαD3a)与化疗联合治疗恶性肿瘤的研究

研究重组人肿瘤坏死因子α衍生物 3a(rh TNFαD3a)与化疗药物联合应用治疗晚期复治乳腺癌、非霍奇金氏淋巴瘤 ,评价其临床疗效及临床安全性。研究表明试验组和对照组疗效比较存在显著性差异 (P <0 .0 1) ,不良反应较轻可耐受 ;rh TNFαD3a和化疗药物联合应用是治疗晚期复治乳腺癌、非霍奇金氏淋巴瘤较为理想的治疗方法     

重组人肿瘤坏死因子α(hTNFα)衍生物发酵条件的研究

本文对一种新型重组人肿瘤坏死因子衍生物（命名为ｈＴＮＦＤ）的发酵条件进行了初步研究。通过实验优化选择了适宜该衍生物表达的培养基、ＩＰＴＧ使用浓度、诱导时期以及诱导时间的长短等,并在５０Ｌ发酵罐进行了中试规模的放大培养,菌体的收获量湿重可达１６４３ｇ／Ｌ,ｈＴＮＦＤ表达量占总蛋白的６０％,纯化的衍生物比活为１０１×１０１０Ｕ／ｍｇ,比原型ｈＴＮＦα提高了４６５倍,具有潜在的临床应用价值。     

3种人肿瘤坏死因子衍生物的研制

本文在详细分析肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）结构的基础上应用ＰＣＲ技术和基因工程手段改造人ＴＮＦ分子,构建了３种人ＴＮＦ的衍生物。３种人ＴＮＦ衍生物是;Ｎ端缺失７个氨基酸且８、９、１０位的ＰｒｏＳｅｒＡｓｐ改为ＡｒｇＬｙｓＡｒｇ的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ１）：Ｃ端１５７位Ｌｅｕ改为Ｐｈｅ的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ２）;Ｎ端和Ｃ端同时作上述改变的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ３）。这３种衍生物在大肠杆菌中均获得较高表述,它们对Ｌ９２９细胞的细胞毒活性较重组天然人ＴＮＦ有很大升高,尤其是ｈＴＮＦＤ１和ｈＴＮＦＤ３,升高达３个数量级。文中对３种衍生物活性升高的原因作了分析。     

基因重组人肿瘤坏死因子-α突变体的构建

在详细分析ＴＮＦ α结构及有关ＴＮＦ α结构与功能关系研究的基础上,设计并人工合成了一对ＴＮＦ α结构基因点突变引物。应用ＰＣＲ和分子克隆技术构建了一种新型人肿瘤坏死因子（ＴＮＦ α）分子的编码基因,将该编码基因插入表达质粒,转化大肠杆菌,通过温度诱导获得了表达蛋白,对突变体克隆进行了ＤＮＡ电泳、酶切位点检测以及基因序列测定,并对突变体蛋白进行了ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳检测。     

抗人重组肿瘤坏死因子(rHTNFα)单克隆抗体的研制

肿瘤坏死因子(TNF)对许多肿瘤细胞具有细胞毒和抑制生长的作用。为进一步研究TNFα的结构和功能,并为临床研究提供rHTNFα纯品。本实验应用杂交瘤技术制备了一组抗rHTNFct单克隆抗体3、H₂、B₃,B₅、E₆、Zl₂、Z₈和Z₂₀)。ELISA结果证实它们鼻rlL－1、rlL-2、rlFNγ、rlFNα₁及E．Coli菌裂解液(MM₂₉₄)无均交叉反应,仅与rHTNFα有反应。Western blot结果进一步证实这组抗体对rHTNFα的特异性。这组抗体具有不同程度中和rHTNFα细胞毒能力。用抗rHTNFα抗体制备的亲和层析柱纯化rHTNFα,可以得到在SDS-PEAG上分子量为17000道尔顿的rHTNFα纯品。     

重组人肿瘤坏死因子纯化方法的探索

ＴＮＦ是一种具有多种生物学作用的细胞因子,高纯度ＴＮＦ的获得是进一步研究其作用机理和探讨防治方法的基础,对克隆后工程菌表达的纯化进行研究,经盐析,透析,离子交换等步骤,成功地制备了高纯度的ｒｈＴＮＦ,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,分子量１７ｋＤ,纯度〉９５％,比活性为３．４４×１０＾７Ｕ／ｍｇ,与国外同产品相似。     

重组人肿瘤坏死因子纯化方法的探索

TNF是一种具有多种生物学作用的细胞因子,高纯度TNF的获得是进一步研究其作用机理和探讨防治方法的基础．对克隆后工程菌表达的纯化进行研究,经盐析。透析、离子交换等步骤,成功地制备了高纯度的rhTNF．经SDS－PAGE测定,分子量17kD,纯度＞95％,比活性为3．44×107U／mg,与国外同类产品相似．     

重组肿瘤坏死因子-α衍生物的制备及聚乙二醇修饰

应用搭桥PCR技术,将肿瘤坏死因子-α基因的前4位氨基酸的编码序列删除,对hTNF-α的第8/9/10/29/31/157位氨基酸的密码子进行定点突变,将突变后的cDNA插入到pBV220载体中构建重组质粒pBV220-tnf-αD4。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选获得了高效表达TNF-αD4突变体的工程菌,表达的重组蛋白约占菌体蛋白总量的45%左右,经硫酸铵沉淀和阳离子交换层析纯化得到纯度达90%以上的重组目的蛋白,比活性达到8×107。用单甲氧基聚乙二醇-丁醛（mPEG-ButyrALD）对TNF-αD4进行修饰,经阳离子交换层析纯化得到纯的mPEG-TNF-αD4,纯度达85%以上,比活性达到8.6 ×107,系统毒性也有了明显的降低。此项工作通过应用PEG修饰肿瘤坏死因子-α,为降低其毒性,增加其活性进行了有益的尝试,为其进一步研究与开发奠定了基础。     

人α－肿瘤坏死因子基因的高效表达

用人工合成的α－肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是ＳＤ序列与起始密码子ＡＴＧ间距离（Ｄ）各异。计算机模拟计算出翻译起始区域（ＴＩＲ）中二级结构的最小生成自由能,以（Ｄ）为６个核苷酸时最小（绝对值）。它的表达效率也最高,产物ＴＮＦ－α可达菌体总蛋白的６０％。密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成ＴＮＦ－α基因（选用大肠杆菌偏爱的密码子）的表达效率高于ｓｃ－     

高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子rhTNFα-DK2的研究

通过对发酵基质和发酵关键参数的优化,确定了发酵培养基的磷酸盐浓度为０．１５Ｍ,甘油浓度为１．２ｍｌ／Ｌ,补料中甘油浓度为２０ｍｌ／Ｌ,发酵过程中溶解氧控制在３０％～６０％,ｐＨ控制在６．８５左右。在５Ｌ在ＮＢＳ－Ｂｉｏｆｌｏ３０００型自动控制发酵罐中采取加速补料的补料分批培养,重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＳＢ－ＴＫ经１０ｈ３０°Ｃ培养和５ｈ４２°Ｃ诱导培养,最终密度达到６０ＯＤ６００,ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２的表达量占菌体总蛋白的５０％以上,每升发酵液纯化可得到近２ｇ的ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２。     

人α－肿瘤坏死因子基因的高效表达

用人工合成的α－肿瘤坏死因子(TNF—α)基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是SD序列与起始密码子ATG问距离(D)各异．计算机模拟计算出翻译起始区域(TIR)中二级结构的最小生成自由能．以(D)为6个核苷酸时最小(绝对值)。它的表达效率也最高,产物TNF—α可达菌体总蛋白的60％．密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成TNF－α基因(选用大肠杆菌偏爱的密码子)的表达效率高于sc－DNA(对部分密码子改造的半合成eDNA)．     

人肿瘤坏死因子衍生物b cDNA的构建与表达

构建了人肿瘤坏死因子缺失1～7位和102～107位共13个氨基酸编码序列的cDNA,即人肿瘤坏死因子衍生物b(rhTNFαDb),转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白量的30%～60％。其中可溶性rhTNFα Db蛋白约占超声上清总蛋白的40%。经柱层析纯化后,目的蛋白纯度达95%以上。以L929细胞株检测rhTNFα Db的细胞毒活性,测得rhTNFα Db的比活性为2×10⁸IU/mg。较rhTNFα 原型提高一个数量级。rhTNFα Db的体内外抑瘤试验也取得了初步结果     

肿瘤坏死因子α与中枢神经系统

肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ,ＴＮＦ）是近年来研究较深入、应用较广泛的一种细胞因子。大部分实验和临床研究都侧重于探索其免疫系统的作用。近几年不少实验证明其与中枢神经系统也有着密切的联系。ＴＮＦ可影响体温调节、自主活动、摄食、睡眠、神经内分泌、镇痛、中枢内感染等。外周ＴＮＦ可进入中枢,中枢自身也可产生ＴＮＦ。     

重组人肿瘤坏死因子α和白细胞介素6融合基因的构建和表达

本文利用ＰＣＲ技术和基因定位突变技术,将编码人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦα）和白细胞介素６（ｈＩＬ－６）成熟肽的基因通过中间接头连接成编码单一蛋白的基因,构建了融合蛋白表达载体ｐＢＩＴ,并在大肠杆菌中得到了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的电泳胶薄层扫描显示,融合蛋白的表达量是菌体总蛋白量的２０％,其分子量约为３７ｋＤ。活性检测证实,融合蛋白既有ＴＮＦ活性,又有ＩＬ－６活性。     

肿瘤坏死因子对人滋养层干扰素α分泌的影响

目的和方法：本文采用人妊娠６～８周胎盘组织块的体外培养方法,通过检测干扰素免疫活性和抗病毒活性研究肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）对人滋养层干扰素（ＩＦＮ）分泌的影响。结果：ＴＮＦα可显著促进人滋养层ＩＦＮα的分泌,并呈剂量和时间依赖关系。同时各浓度的ＴＮＦα还可促进βＨＣＧ的分泌,并呈一定的剂量依赖关系。此外,我们还证明ＩＮＦα可显著抑制人滋养层细胞的生长,而ＴＮＦα则无明显作用。结论：ＴＮＦα可通过促进人滋养层干素α和βＨＣＧ的分泌,从而影响人胎盘的功能活动     

肿瘤坏死因子α与肥胖的研究进展

肥胖症作为一种能量代谢性疾病,已成为世界范围内的健康问题.肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)是一种多效性细胞因子,在肥胖发生过程中起着非常重要的作用.TNF-α可以通过影响体内糖代谢、脂代谢及炎症反应参与肥胖的发生过程.本文就TNF-α在肥胖的发生过程中的作用做一简要综述.     

α-肿瘤坏死因子的肿瘤靶向性改造

α-肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一种多效性的细胞因子,能高效地杀伤或抑制肿瘤细胞。但是由于其对全身有毒副作用,这使T N F-α的应用受到了限制。提高T N F-α的抗肿瘤活性,降低毒副作用以及开发具有肿瘤靶向性的融合蛋白是将其应用于临床的关键。     

利用Ph电极流加葡萄糖培养重组大肠杆菌生产人α-肿瘤坏死因子的研究

应用一种新型的pH电极流加葡萄糖方法,用于培养重组大肠杆菌生产人α-肿瘤坏死因子。流加后培养液中菌体OD₆₀₀达到9.0,而α-肿瘤坏死因子的比活保持1.05±0.11×10⁵u/mg。与指数流加方法比较,二者能达到的最大菌体密度相近,而利用pH电极流加葡萄糖更具有设备简单,操作方便的特点。