大规模培养哺乳动物细胞的径向流动中空纤维生物反应器

已研制成径向流动中空纤维生物反应器,该反应器最大限度地利用纤维表面于细胞生长,同时消除了常规中空纤维管内固有的养料梯度和代谢梯度。该反应器由中心流动分配管及其周围的环形中空纤维床组成,中心流动分配管保证轴向均匀径向传送的养料流横穿过纤维床,细胞在纤维外表而附着并增生,纤维经多聚赖氨酸预处理。     

连续灌流培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体

自 2 0世纪 70年代以来 ,工程抗体在基础医学研究、临床诊断和治疗 ,以及免疫预防等领域中的广泛应用 ,大大促进了其产业化的进程。目前工业化生产单克隆抗体的主要方法是通过发酵罐、中空纤维和固定床等生物反应器培养系统 ,以微载体、微包囊法在体外大规模高密度培养杂交瘤细胞 ,再通过相关的纯化手段浓缩纯化制备抗体[1 ,2 ] 。就操作方式而言 ,一般采用两个基本策略 :①大容量高密度的悬浮培养 ,最多采用的是搅拌式气升式生物反应器 ,通过微载体依托细胞相对固定化 ,降低了搅拌培养时对细胞的剪切力 ,提高细胞的密度和稳定性及生产率。…     

固定化细胞膜反应器生产6－APA的研究

将青霉素酰化酶基因工程菌大肠杆菌A56(pPA22)通过交联截留固定化在由中空纤维膜或平板膜构成的膜反应器内,提高了单位体积反应器的酶活,实现了高浓度青霉素的裂解。采用反冲模式操作的中空纤维膜反应器裂解7．8％医用青霉素钠盐50批,产品6－APA的平均重量收率达到90．1％,纯度达98．6％,50批反应操作后,膜反应器内剩余酶活力仍在80％以上。     

动物细胞培养用生物反应器及相关技术

动物细胞大量培养是生产生物制品的重要途径,它用到的关键设备是生物反应器。根据培养细胞、培养载体、培养液混合方式的不同,生物反应器主要有搅拌式、气升式、中空纤维式、回转式等,其中搅拌式规模最大。回转式是NASA于20世纪90年代中期开发的一种新型生物反应器,被誉为空间生物反应器,可用于组织工程研究。与生物反应器配套的技术主要有灌注、微载体、多孔微球、转入抗凋亡基因等,可以有效地提高细胞密度,增加生物制品产量,提高质量。今后生物反应器研制主要朝两个方向发展:一是,以高密度培养动物细胞生产蛋白质药物为目的,二是以三维培养动物细胞(主要是人类细胞)再生组织或器官为目的。     

杂交瘤细胞体外大规模培养研究进展

单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值,是免疫检验中的新型试剂,是生物治疗的导向武器。作为医学检验试剂,单克隆抗体可以充分发挥其优势,如特异性好,灵敏度高,更便于质量控制,利于标准化和规范化。传统的方法是利用小鼠腹水制备单克隆抗体,但是近几十年杂交瘤细胞体外大规模培养制备单克隆抗体技术也在不断发展。特别是单克隆抗体在疾病诊断和治疗方面的需求,更进一步促进了杂交瘤细胞体外培养生产技术的发展,体外培养杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已应用到许多方面。由于杂交瘤细胞的半贴壁性质,无论是悬浮培养还是贴壁培养,均可进行杂交瘤细胞的体外大规模培养。针对应用于体外诊断试剂的杂交瘤细胞体外培养制备单克隆抗体进行综述,主要包括中空纤维细胞培养和生物反应器细胞培养方法,以及不同培养方法优化的进展。     

耦合中空纤维膜超滤分离游离细胞催化合成ATP

对耦合中空纤维膜超滤分离进行游离细胞催化合成ATP过程进行了实验研究,考察了细胞的催化效率和膜组件的操作稳定性。结果显示,中空纤维超滤膜的耦合分离能有效地截留反应液中的游离酶,其中乙醇脱氢酶(ADH)和已糖激酶(HK)的稳态截留效率在95%以上。耦合膜分离的酵母细胞催化ATP合成反应可重复使用2.5～3.0次,酶的利用率比普通分离的细胞提高2.0～2.5倍。中空纤维超滤膜于0.1Mpa工作压力下连续11批耦合分离操作,膜的渗透性无明显下降,过滤速率保持在初速率的95%以上。在稀释速率0.25h-1下,反应体系保持了连续5h的ATP高转化率合成与分离耦合的拟稳态操作。     

人工基膜对鼻咽癌上皮细胞株（CNE—2）生长的影响

人工基膜（ＡＢＭ）主要以Ⅰ型胶原的水合性胶原丝网为网架,辅上纤维连结蛋白,Ⅳ型胶原和层粘连蛋白等主要基膜糖蛋白制备而成,具海绵状的形态结构。ＡＢＭ可减少胎牛血清用量１０％,提高细胞生活力和延长细胞传代周期。在２－５％血清浓度的情况下,ＡＢＭ可提高ＣＮＥ－２细胞的生长效率,克隆形成率和克隆生长率而抑制细胞的＾３Ｈ－ＴｄＲＡ掺入。提示在体外研究细胞外基质对细胞的影响时应使用低血清培养液。ＡＢＭ是体外诱     

表达内皮抑素的rCHO细胞的微囊化培养

微囊化重组基因细胞移植治疗肿瘤是一种新兴的肿瘤基因治疗方法,如果将此技术应用到临床研究,就需要制备大量的细胞活性良好、重组蛋白表达量高的生物微胶囊。种子细胞是生物微胶囊治疗作用的执行者, 是构建微囊微反应器的基本元素。如何获得大量高活性的种子细胞已经成为规模化制备生物微胶囊所面临的最关键的限制因素。本实验考察了搅拌式生物反应器内扩增的重组CHO细胞进行包囊及微囊化细胞在生物反应器内规模化培养的可行性。实验结果显示:重组CHO细胞在生物反应器内可以快速生长,并且对数期细胞包囊,微囊化细胞活性良好。制备的微囊化细胞可以在生物反应器内培养,与培养板培养比较细胞生长较快、内皮抑素表达量较高。应用生物反应器培养技术能够在体外快速、大量扩增重组CHO细胞,满足微囊化细胞制备对种子细胞量与质的要求,微囊化细胞可以在生物反应器内培养。     

大鼠纹状体边缘区与Meynert氏基底核的突触联系及其与学习记忆功能的关系——WGA-HRP束路追踪法、电镜法和行为实验法研究

纹状体边缘区（ＭｒＤ）是我们先后在大鼠、猫和猴脑内新发现的一个区域。它是位于纹状体尾内侧、环绕着苍白球头外侧的一层梭形细胞。ＭｒＤ的细胞构筑、免疫组化特性和纤维联系形式不同于纹状体其它区。ＭｒＤ的离心投射终止在苍白球尾侧,接近Ｍｅｙｎｅｒｔ基底核（ＮＢＭ）附近。损毁双侧ＭｒＤ后,动物的学习记忆功能减弱。ＮＢＭ已知与动物智能有关。本研究用纤维溃变和束路追踪电镜法结合行为实验方法,旨在了解ＭｒＤ与ＮＢＭ之间有无突触联系,以及此种联系与动物学习记忆的关系。用纤维溃变和束路追踪电镜法研究表明,由ＭｒＤ发出的纤维终末与ＮＢＭ的胆碱能神经元胞体间存在着突触联系。损伤ＭｒＤ造成ＭｒＤ和ＮＢＭ形成突触联系的终末溃变后,动物的学习记忆能力降低。研究结果表明边缘区与Ｍｅｙｎｅｒｔ基底核间存在着突触联系,而这种联系很可能是ＭｒＤ的学习记忆功能的结构基础之一。     

固定化细胞生产L—苹果酸动力学及两种酶反应器的比较

研究了产氨短杆菌ＭＡ－２,黄色短杆菌ＭＡ－３的固定化细胞在富马酸铵转化体系中生成Ｌ－苹果酸的动力学参数,同时比较了固定化细胞在填充床及连续机械搅拌反应器中酶转化反应的差异。研究结果表明：当转化率小于４０％时,酶反应在两种反应器所需的停留时间相当。随着转化率的提高,填充床反应器较连续机械搅拌反应器所需的停留时间短且不会因剪切力使固定化颗粒受到损伤,因此,在富马酸铵体系中用固定化酶生产Ｌ－苹果酸采用填     

原位吸附浸没式膜生物反应器催化制备茚二醇

在浸没式膜反应器(IMB)中利用恶臭假单胞菌ATCC 55687催化茚制备顺式茚二醇。采用25根膜丝制作的膜组件,在茚为3 g/L时,经过24 h培养,IMB中顺式茚二醇产量达到悬浮细胞反应器(SCB)的4倍多;进一步,在培养开始阶段加入10 g/L sp-207树脂进行原位吸附,IMB中顺式茚二醇产量最高达709 mg/L,为SCB产量的660%,容积产率也从SCB中的6 mg/(L·h)提高到30 mg/(L·h)。在原位吸附IMB中,中空纤维膜既可作为固定化细胞载体,同时又可作为第二相吸附不溶性底物,降低底物和产物抑制,兼有固定化反应器和两相反应器的优点。     

牛胚胎生殖细胞的分离与培养

胚胎生殖细胞 (Embryonicgermcells,EG)是由生殖嵴原始生殖细胞 (Primordialgermcells,PGCs)中分离得到的一种未分化而多潜能的干细胞。牛EG细胞的研究在EG细胞核移植、转基因及建立生物反应器方面具有广阔的应用前景。本研究从 2 9- 70日龄牛胎儿PGCs分离得到EG细胞 ,经过抑制分化培养 ,其中一个细胞系传至 6代。所分离得到的EG细胞具有典型的EG细胞形态 ,AP及PAS染色呈阳性 ,核型正常 ,同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化 ,可形成类胚体、成纤维样细胞及神经样细胞     

能同时分离精制的生物反应器

日本电气工业公司开发成功由酶进行生化反应和反应器中生成的物质分离精制同时进行的生物反应器。方法是将酶固定在多孔质的中空系上,基质溶液流入反应器115支的中空系束的园筒状中空系膜上     

应用中空纤维膜去除无细胞百日咳料液中的脱毒剂和色素

目的应用中空纤维膜洗滤技术去除无细胞百日咳料液中的脱毒剂和色素。方法采用不同浓度的盐溶液作为中空纤维膜洗滤液,通过洗滤过程的水通量衰减程度,洗滤后制品外观和蛋白回收率,原液戊二醛残留量,原液效价和毒力来确定洗滤液。用物理和化学清洗相结合的方式对使用后的膜进行清洗再生,以水通量恢复率对清洗效果进行评估。结果用盐溶液Ⅱ作为洗滤液,在洗滤过程维持跨膜压基本恒定的情况下,中空纤维膜水通量大、且衰减缓慢,洗滤后收集的制品外观呈淡黄色,蛋白颗粒均匀,蛋白回收率高,所制备原液的戊二醛残留量、效价和毒力检定结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求。中空纤维膜使用后,用物理和化学清洗相结合的清洗方式使中空纤维膜的水通量恢复率分别达99.06%,98.11%,99.62%。结论中空纤维膜可用于去除无细胞百日咳料液中的脱毒剂和色素。     

中空纤维测定法在抗肿瘤药物研究中的应用

中空纤维测定法是NCI建立的体内抗肿瘤药物筛选方法。本文介绍了中空纤维测定法的基本实验方法和疗效评判标准,回顾了近年基于中空纤维测定法的抗肿瘤药物方面的研究成果,认为中空纤维测定法不仅适用于药物筛选,在快速研究抗肿瘤药物药效和机制方面也具有重要的应用价值。     

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

目的探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞,以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物。方法采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养,诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞,对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估。在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上,体外构建小口径组织工程血管。结果犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,可以作为血管组织工程的种子细胞。经过脱细胞处理后,光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除。具有良好的孔径和孔隙率。支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求。在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管。结论小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞,以异种脱细胞血管支架作为基质,在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建。     

小鼠膀胱上皮的中间层细胞中存在Uroplakins

本文运用超薄切片、冰冻蚀刻及免疫胶体金标记等多种电镜技术并结合免疫组化,免疫荧光染色技术,直观地显示出小鼠膀胱上皮的中间层细胞存在Ｕｒｏｐｌａｋｉｎｓ,并在梭形泡膜上形成了与表细胞类似的ＡＵＭ结构,而且梭形泡的ＡＵＭ结构也结合在中间纤维上,白质免疫印迹反应进一步证实中间层细胞含有与表层细胞相同的ＵｒｏｐｌａｋｉｎＩ和ＵｒｏｐｌａｋｉｎⅢ等ＡＵＭ蛋白的主要成分,从而为ＡＵＭ的发生及其与细胞分化关系的     

用无血清培养基在填充床生物反应生产rHuEPO

在填充床生物反应器用含５％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ：Ｆ１２培养基培养产重组人促红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）的细胞Ｃ２８￣１０ｄ后,使用自制的无血清生产培养基（ＳＦＭ－ｐ）生产ｒＨｕＥＰＯ。ＳＦＭ－ｐ培养基既能维持细胞生长,又能生产ＥＰＯ,也便于纯化分离ｒＨｕＥＰＯ。使用填充床生物反应器培养细胞,能维持培养２０￣２５ｄ,ｒＨｕＥＰＯ表达水平达１２￣２８．４ｍｇ／Ｌ之间,反应器的产率达到７１．０ｍｇ／Ｌ／ｄ,     

用无血清培养基在填充床生物反应器生产 rHuEPO

在填充床生物反应器用含５％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ：Ｆ１２培养基培养产重组人促红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）的细胞Ｃ_２８～１０ｄ后,使用自制的无血清生产培养基（ＳＦＭｐ）生产ｒＨｕＥＰＯ。ＳＦＭｐ培养基既能维持细胞生长,又能生产ＥＰＯ,也便于纯化分离ｒＨｕＥＰＯ。使用填充床生物反应器培养细胞,能维持培养２０～２５ｄ,ｒＨｕＥＰＯ表达水平达１２～２８.４ｍｇ／Ｌ之间,反应器的产率达到７１.０ｍｇ／Ｌ／ｄ,比滚瓶的产率增加１２～１４倍。葡萄糖最高消耗量达到２１ｇ／Ｌ／ｄ,细胞培养密度最高达到３.０×１０^７／ｍｌ以上,每次可收无血清培养上清８０～８７Ｌ。由于细胞被固定在聚酯片上,培养上清中脱落细胞很少。观察了反应器的乳酸和氨的含量,其结果表明乳酸和氨含量分别低于３.５ｇ／Ｌ和５ｍｍｏｌ／Ｌ,不影响产物的表达。经过多批培养和生长ｒＨｕＥＰＯ的结果表明,自行配制的ＳＦＭｐ培养基在该反应器能有效地维持细胞生长和生产ｒＨｕＥＰＯ。     

低氧对CRF,AVP和NE刺激体外培养腺垂体细胞生成cAMP的影响

本文探讨了ＣＲＦ,ＡＶＰ及ＮＥ对体外培养大鼠腺垂体细胞生成ｃＡＭＰ的作用。ＣＲＦ刺激体外培养大鼠腺垂体细胞内ｃＡＭＰ的生成,且浓度与效应正相关。ＡＶＰ未引起细胞内ｃＡＭＰ差异性变化（Ｐ＞０．５）。ＮＥ使培养腺垂体细胞内ｃＡＭＰ水平降低。低氧使ＣＲＦ刺激ｃＡＭＰ生成的作用降低。而ＡＶＰ及ＮＥ可能是通过其它胞内信息通路。