棉铃虫病毒gp41基因的克隆表达及抗体制备

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)gp41基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点,通过PCR的方法扩增目的片段。将扩增出的基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组质粒并转化至大肠杆菌中,经IPTG诱导表达。纯化蛋白产物并免疫家兔产生抗血清。该抗血清可与原核表达的His-GP41融合蛋白及在感染的昆虫细胞中表达的GP41蛋白发生特异性免疫反应。该抗体的获得为深入研究GP41的功能提供了基础。     

大鼠脑红蛋白(NGB)的原核表达、抗体制备及其细胞分布

脑红蛋白 (NGB)是新发现的与脑内氧供应密切相关的分子 .为了检测细胞内脑红蛋白的表达、亚细胞分布从而对该分子进行深入的功能研究 ,成功地将大鼠脑红蛋白基因编码区构建于原核表达载体pGEX 4T 2 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,获得融合表达产物 .对含有融合蛋白的包含体进行溶解和复性 ,用谷胱甘肽S 转移酶 (GST)亲和层析柱纯化 ,通过免疫家兔获得了兔源性抗NGB多克隆抗体 .采用Western印迹分析技术 ,用该抗体检测NGB基因的真核表达产物 ,证明该抗体有较好的针对NGB蛋白的专一性 ,可用于对NGB的结构和功能研究 .同时 ,用该抗体进行免疫组化分析发现 ,正常成年大鼠神经系统中有较多的NGB免疫反应阳性细胞分布 ,提示NGB是与神经系统功能密切相关的重要分子     

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白的表达、抗体制备及亚细胞定位

ns2是黑胸大蠊浓核病毒的一个非结构基因, 所编码的蛋白质大小为30 kD, 是一个功能未知的基因。为了对该基因进行深入的功能研究, 从感染了黑胸大蠊浓核病毒的蟑螂的后肠组织中通过RT-PCR得到ns2基因编码序列, 将其构建于原核表达载体pET-28a, 转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得融合表达产物。此融合蛋白经分离纯化后, 免疫新西兰大白兔, 制备其多克隆抗体。采用Western印迹技术, 用该抗体检测ns2基因的真核表达产物, 证明该抗体有较好的针对NS2蛋白的专一性, 可用于对NS2结构和功能的研究。同时, 将此编码序列克隆至果蝇细胞表达载体pAC, 得到重组质粒后转染果蝇S2细胞表达重组蛋白, 通过共聚焦显微镜用该抗体检测该蛋白在S2细胞中的亚细胞定位, 发现NS2蛋白主要定位于细胞质, 核内仅有少量分布。     

HCV包膜蛋白E2的克隆、表达与检测

构建丙型肝炎HCV包膜蛋白糖蛋白的E2基因原核表达载体,获得大量重组HCVE2蛋白,进行E2蛋白的抗原性及潜在保护作用研究。通过RT-PCR从HCVRNA阳性血清标本中扩增出975bp(383～708)E2基因片段,PCR产物经EcoR I和Sall I双酶切后连接到经同样酶切的PET-41a原核表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经Amp筛选,得到阳性重组质粒PET41a-HCVE2菌株,并以IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE鉴定,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用ELLSA方法检测生物学活性。结果表明,构建的HCVE2包膜蛋白基因片段原核表达质粒所表达产物主要以包涵体形式存在,表达的融合蛋白与HCV阳性血清具有较好的反应原性。以HCVE2融合蛋白检测患者阳性血清具有良好的抗原性,有望能提高HCV抗体检测试剂盒的检出率。     

棉铃虫核型多角体病毒orf86基因的原核表达、抗体制备与免疫印迹检测

棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)orf86是一个功能未知的基因。从HearNPV基因组中通过PCR得到orf86基因编码序列,将其构建于原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21获得融合表达产物。融合表达蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体。用ELISA测定结果表明,ORF86多克隆抗体效价为1:5.12×105。利用该抗体Western印迹检测HearNPV感染的HZAM1细胞,检测到一个36kD的目的蛋白条带,与ORF86预期大小一致。结果表明该多抗可用于对orf86编码蛋白的检测和相关功能研究。     

SUA41蛋白表达和纯化及其多克隆抗体制备

旨在制备特异性SUA41多克隆抗体,为深入研究其在植物生长发育中的功能提供有力的分子生物学和生物化学的工具。PCR扩增拟南芥SUA41基因中编码280个氨基酸(401-680位氨基酸)的特异片段,经过GATEWAY的DNA重组技术构建了原核表达载体pDEST17-SUA41,用热休克法转化到E.coliBL21(DE3)star感受态细胞,以异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出6×His-SUA41融合蛋白,用8 mol/L尿素缓冲液溶解包涵体并且经过水逐级去除尿素获得提纯的融合蛋白,并利用Western blotting鉴定确认。融合蛋白经Ni金属螯合柱亲和层析得以纯化,用SDS-PAGE进一步纯化。纯化的融合蛋白经过SDS-PAGE后切胶回收,免疫小白兔,制备多抗血清,然后用Western blotting进行检测,鉴定血清特异性和效价。结果显示,融合蛋白6×His-SUA41免疫兔,产生特异性的SUA41兔抗血清,可以检测到细菌和拟南芥组织中SUA41蛋白。用水提纯变性剂尿素溶解的包涵体蛋白具有可行性。制备的特异性SUA41兔抗血清效价高,能够有效地识别大肠杆菌表达的和拟南芥的SUA41蛋白。在有合适的对照情况下,该兔抗血清可以用于分析植物中SUA41蛋白的功能。     

KCTD10基因的表达、抗体制备及其在常见细胞系中的表达

人类KCTD10(channe l tetram erisation dom a in-conta in ing 10)基因属于PD IP1(polym erase de lta-interactingprote in 1)基因家族。最近的研究表明,小鼠KCTD10能同时和PCNA以及DNA聚合酶δ相互作用,并受肿瘤坏死因子α诱导;可能在诸如DNA修复、DNA复制、细胞周期调控以及人类的多种疾病中发挥重要作用,但对其确切功能和作用机制研究不多。克隆人的KCTD10基因到pQE-N3原核表达载体,在原核细胞株BL21(DE3)中表达并获得融合表达产物。获得的融合蛋白产物通过免疫新西兰大白兔获得兔抗KCTD10多克隆抗体。采用western印迹技术,用该抗体检测KCTD10基因的原核和真核表达产物,证明该抗体有较好的针对KCTD10蛋白的专一性,可用于对KCTD10的结构与功能研究。同时利用实时定量PCR的方法检测该基因在几种常见细胞系的表达情况,发现在N IH3T3细胞系中表达较高,而在HeLa、HepG2、SW 480、PanC1、MCF7等癌细胞系中表达较低,由此推测KCTD10可能在癌症的发生中起到一定的作用。     

跨膜逆向转运蛋白NHXFS1多克隆抗体的制备及应用

NHXFS1基因是通过DNA家族改组（DNA family shuffling）技术,以拟南芥、水稻和菊花的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因（NHX1）为亲本获得的活性显著增强的新基因。为制备该蛋白的多克隆抗体,对该蛋白进行跨膜结构分析,选取跨膜蛋白的C末端为靶标,并将其克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建了原核融合蛋白pET32a-NHXFS1-抗原表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。通过镍柱亲和层析纯化该融合表达蛋白,获得了纯度约为80%的纯化蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。ELISA实验表明,该抗体的效价达到1：128 000,提取表达NHXFS1蛋白的酵母液泡经该多克隆抗体Western blot检测,证明该抗体具有较好的NHXFS1蛋白特异性。NHXFS1多克隆抗体的制备为进一步认识NHXFS1新蛋白结构与功能以及植物耐盐分子生物学的研究奠定了基础。     

人FBXO31蛋白的原核表达及抗体制备

FBXO31位于人染色人体16q24.3,是一个乳腺癌候选抑癌基因。为了获得抗FBXO31的多克隆抗体,构建了FBXO31基因的原核表达质粒pET-28a-FBXO31。将原核表达质粒pET-28a-FBXO31转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,IPTG诱导表达融合蛋白。融合蛋白主要以包涵体形式存在,常规方法纯化包涵体。将纯化的pET-28a-FBXO31融合蛋白用于免疫新西兰大白兔获得抗血清,用pET-28a-FBXO31对抗血清进行分离纯化,得到抗FBXO31多克隆抗体。用Western印迹和免疫沉淀对其进行初步鉴定。获得了兔抗人FBXO31的多克隆抗体,为进一步研究FBXO31的生物功能提供了有用的工具。     

水稻YTB中OSVDAC5蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆水稻YTB osvdac5基因,原核表达后获得纯化的OSVDAC5蛋白,制备相应的抗体.方法:采用Trizol法提取水稻总mRNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增得到该基因与原核表达载体连接,构建重组质粒pET-30a-osvdac5,并转入大肠杆菌进行原核表达,SDS-PAGE检测表达产物.通过镍柱纯化获得的单一目的蛋白用于抗体制备,用Western Blot检测抗体的特异性.结果:克隆到原核表达载体中osvdac5基因的ORF为813 bp,编码271个氨基酸.在大肠杆菌中15℃、0.7mmol/L的IPTG浓度诱导17 h是pET-30a-osvdac5融合蛋白表达的优选条件,表达的OSVDAC5蛋白属于包涵体蛋白.镍柱纯化后的OSVDAC5为30 kD左右的单一条带.Western Blot分析表明,抗体能够与30 kD处的OSVDAC5蛋白进行特异性结合.结论:成功克隆了水稻YTB osvdac5基因,原核表达蛋白OSVDAC5制备的多免隆抗体具有一定特异性,能与免疫抗原结合,这为进一步研究OSVDAC5蛋白在植物不同生长发育时期中的表达模式奠定了基础.     

人源抗狂犬病毒单链抗体基因原核表达质粒的构建及高效表达

在原核系统中高效表达抗狂犬病毒单链抗体scFv41,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景。以重组质粒pCANTABscFv41为模板,PCR扩增带NcoI和NotI位点的scFv41基因,克隆入原核表达载体pET-22b( ),酶切鉴定重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。竞争ELISA检测表达蛋白的特异结合活性。酶切鉴定证实scFv41基因已插入原核表达载体pETl-22b( ),重组表达质粒pET-scFv41在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达量约占菌体蛋白总量的30％。竞争ELISA检测结果表明scFv41表达蛋白可特异抑制抗狂犬病毒IGY与狂犬病毒的特异性结合。该实验为进一步研究scFv41的生物学特性和免疫保护作用,及基因工程抗体的制备奠定了基础。     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的：构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法：通过佛波酯（TPA）和植物球血凝素（PHA）刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a（＋）中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果：酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a．IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论：成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

靶向性DNA甲基化酶在pET32a原核表达载体中的表达和鉴定

目的:在pET32a原核表达载体中表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶B1-3a并进行鉴定。方法:以含有B1-3a基因的pcDNA4.0-B1-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段B1-3a,然后克隆入表达载体pET32a;以SDS-PAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定。结果:表达产物中在分子量43kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被6his标签单克隆抗体特异识别。结论:正确构建了靶向性甲基化酶B1-3a的原核表达载体,靶向性甲基化酶能够在pET32a中成功表达。     

人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析

为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。     

抗菌肽Cec4a的重组表达和抗菌活性研究*

目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性。方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段。利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白。在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示菌检测表达产物的抗菌活性。结果:成功构建pCold-SUMO-Cec4a原核表达质粒,测序分析其序列与预期结果一致。Cec4a融合蛋白表达量为42.8mg/L,纯化后的Cec4a重组蛋白对鲍曼不动杆菌的MIC为4 μg/mL。结论:通过原核表达,并经Ni-NTA亲和层析纯化,获得了具有抗菌活性的重组蛋白Cec4a,为研究Cec4a的生物活性、抗菌机制及应用奠定了基础。     

甲基丙二酰辅酶A 变位酶表达载体的构建及初步表达

目的:克隆表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)蛋白,为进一步研究相关基因突变对功能的影响机制奠定基础。方法:自人外周血淋巴细胞中提取总RNA、逆转录,并与pET32a构建融合蛋白原核表达载体;优化蛋白表达诱导条件;经SDS-PAGE、WesternBlot检测目的蛋白的表达。结果:经酶切鉴定并经测序证实获得全长2210bp的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因(MUT),并成功构建融合蛋白原核表达载体,SDS-PAGE在102 kDa处获得目的条带,Western Blot检测确定为MCM表达蛋白。结论:成功克隆表达出MCM表达蛋白。     

HIV-1 gp41的酵母表面展示及表达优化

以His标签检测蛋白的表达, 利用酿酒酵母表面展示系统, 成功地将HIV-1 gp41片段锚定在酵母表面, 并检测到gp41的活性。以pMD18T-gp41为模板, 通过PCR技术克隆了gp41基因, 将gp41基因通过双酶切连接到载体pICAS-His上,构建了gp41酵母表面展示载体, 并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中。重组菌经培养, 利用免疫荧光染色方法进行染色, 显微镜观察发现重组酵母细胞表面有绿色荧光, 流式细胞仪结果进一步证实gp41正确折叠展示于酵母细胞表面。采用不同浓度的葡萄糖培养基进行表达优化。当葡萄糖浓度为1%时, 82.46%的酵母细胞表达了gp41抗原; 随着葡萄糖浓度升高, 蛋白表达受到抑制。